《Pathogens》：Molecular and Phenotypic Characterization of MDR and XDR Aeromonas spp. Isolated from Hospital Wastewater
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医院废水（HWW）日益被认为是抗菌素耐药性（AMR）选择与传播的环境热点。尽管监测项目主要针对ESKAPE病原体，但诸如气单胞菌属（Aeromonas spp.）等环境细菌的贡献仍未被充分表征。本研究旨在调查自HWW中回收的气单胞菌属的抗菌素耐药机制，重点关注
医院废水（HWW）日益被认为是抗菌素耐药性（AMR）选择与传播的环境热点。尽管监测项目主要针对ESKAPE病原体，但诸如气单胞菌属（Aeromonas spp.）等环境细菌的贡献仍未被充分表征。本研究旨在调查自HWW中回收的气单胞菌属的抗菌素耐药机制，重点关注碳青霉烯和头孢菌素耐药性。研究人员通过rpoD限制性片段长度多态性分析鉴定了30株气单胞菌分离株，并利用抗菌药敏试验、β-内酰胺耐药基因检测、1型整合子检测及ERIC-PCR指纹分析对其进行了表征。所有分离株均呈现操作定义的多重耐药（MDR）或广泛耐药（XDR）表型，耐药性主要集中于头孢菌素、碳青霉烯和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑。PCR检测到临床相关的基因家族/组blaKPC家族、blaOXA-48-like、blaCTX-M group 1和blaSHV，而blaNDM、blaVIM、blaIMP和mcr-1均未检出。36.7%的分离株中鉴定出1型整合子，揭示了携带dfrA和aadA耐药基因的多种基因盒阵列。ERIC-PCR显示出高度指纹多样性和有限的遗传相关性。对HWW的微生物学监测表明，气单胞菌种群构成了临床相关β-内酰胺耐药决定因子的环境储库，支持进一步评估其在医院-环境界面AMR监测策略中的潜在作用。
**研究背景与问题**
抗菌素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁，严重削弱了临床抗感染治疗的选择。以往研究多聚焦于医疗机构和社区中抗菌药物的不合理使用，但近年来越来越多的证据表明，环境储库在耐药决定因子的维持与传播中同样扮演重要角色。医院废水（HWW）持续接收抗菌药物残留及耐药微生物，为耐药菌的选择和水平基因转移创造了有利条件，构成复杂的生态系统。既往HWW监测主要集中于ESKAPE病原体（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属），而对环境本底细菌如气单胞菌属（Aeromonas spp.）的耐药贡献尚缺乏系统认识。气单胞菌属广泛分布于水生环境和排水系统，既能引起社区获得性和医院相关性感染，又频繁携带临床相关耐药决定因子，因此被认为是连接环境和临床耐药储库的潜在哨兵微生物。此前研究人员在HWW中证实气单胞菌属与携带临床相关β-内酰胺类抗生素残留的耐药ESKAPE病原体共存，提示该属可能在医院-环境界面参与耐药基因的传播。
**研究概述与结论**
研究人员基于墨西哥城Hospital Juárez de México（HJM）的HWW监测体系，对先前收集的30株气单胞菌分离株进行了物种鉴定、抗菌药敏表型分析、β-内酰胺耐药基因检测、1型整合子结构分析和ERIC-PCR分子分型。结果显示，所有分离株均呈现操作定义的多重耐药（MDR）或广泛耐药（XDR）表型，以头孢菌素、碳青霉烯和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药为主；PCR检出blaKPC家族、blaOXA-48-like、blaCTX-M group 1和blaSHV等临床相关耐药基因；36.7%的分离株携带1型整合子，其中基因盒阵列携带dfrA和aadA耐药基因。该研究揭示了HWW中气单胞菌种群构成临床相关β-内酰胺耐药决定因子的环境储库，提示应将环境细菌纳入医院-环境界面的AMR监测策略，但尚需更大规模研究验证。
**关键技术与方法**
该研究使用了以下主要技术方法：物种鉴定采用rpoD基因限制性片段长度多态性（RFLP）分析；抗菌药敏试验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）M45标准以纸片扩散法完成；碳青霉烯酶表型筛查采用改良碳青霉烯灭活法（mCIM）；超广谱β-内酰胺酶（ESBL）生产采用组合纸片法；耐药基因检测采用终点PCR法，覆盖金属β-内酰胺酶基因（blaNDM、blaVIM、blaIMP）、丝氨酸碳青霉烯酶基因家族/组（blaKPC、blaOXA-48-like）、ESBL基因（blaSHV、blaCTX-M group 1）及质粒介导多黏菌素耐药基因mcr-1；1型整合子的可变区经PCR扩增后测序并比对GenBank；遗传相关分析采用ERIC-PCR结合Dice系数和UPGMA聚类法。样本来源为HJM五个废水排放点每月采集的60份废水样本，菌株来自先前建立的耐药革兰阴性菌库。
**主要研究结果**
**3.1 气单胞菌分离株的rpoD-RFLP物种鉴定**
rpoD-RFLP分析将30株气单胞菌归入6个物种，其中维氏气单胞菌（A. caviae）为最优势种（n=14），其次为中间气单胞菌（A. media，n=5）、维罗纳气单胞菌（A. veronii，n=4）、杀鲑气单胞菌（A. salmonicida，n=4）、达卡气单胞菌（A. dhakensis，n=2）和简氏气单胞菌（A. jandaei，n=1）。与MALDI-TOF MS初检相比，rpoD-RFLP发现物种鉴定不一致，1株原鉴定为嗜水气单胞菌（A. hydrophila）的菌株被重新归为A. media，2株原鉴定为A. caviae的菌株被重新归为A. dhakensis，提示MALDI-TOF MS对气单胞菌属内近缘物种的鉴别能力有限。
**3.2 抗菌药敏表型分析**
所有30株均呈现操作定义的MDR（36.7%）或XDR（63.3%）表型，未检出泛耐药（PDR）菌株。头孢菌素类中头孢噻肟和头孢曲松耐药频率最高，所有A. caviae、A. media、A. veronii、A. dhakensis和A. jandaei菌株至少对一种头孢菌素耐药；A. media对所有测试头孢菌素均呈现持续高耐药率。碳青霉烯类中厄他培南（46.7%）和美罗培南（40.0%）耐药率较高，66.7%的菌株至少对一种碳青霉烯耐药，且主要集中于A. caviae和A. media，仅A. veronii菌株AV-199对所有三种碳青霉烯均耐药。甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药率高达80.0%，多黏菌素耐药率仅为16.7%，A. caviae、A. media和A. salmonicida中均有耐药菌株检出。
**3.3 耐药基因分布**
PCR检测显示blaCTX-M group 1（30%）为最常检出的ESBL基因，其次为blaKPC家族（20%）、blaOXA-48-like（13.3%）和blaSHV（6.6%），blaNDM、blaVIM、blaIMP和mcr-1均未检出。A. caviae和A. media贡献了大多数blaKPC家族、blaCTX-M group 1和blaSHV阳性菌株，其中A. caviae菌株AC-114同时携带三种目标耐药基因。blaOXA-48-like在A. salmonicida（3株）和A. jandaei（1株）中检出，A. dhakensis菌株AD-089同时携带blaCTX-M group 1和blaSHV，A. jandaei菌株AJ-004同时携带blaOXA-48-like和blaCTX-M group 1。
**3.4 1型整合子结构与基因盒阵列**
36.7%（11/30）的分离株携带1型整合子，以A. caviae（n=5）最多，A. media（n=3）、A. salmonicida（n=2）和A. jandaei（n=1）次之，A. veronii和A. dhakensis中未检出。结构分析鉴定出两种整合子构型：6株携带含基因盒的完整intI1-可变区-qacEΔ1-sul1结构，5株携带约150 bp可变区的无基因盒整合子。序列分析在可变区中鉴定出5种不同的基因盒阵列：dfrA17-aadA5、dfrA12-aadA2、dfrA7-aadA1、dfrA5和dfrA48，分别编码甲氧苄啶和氨基糖苷类耐药。含基因盒整合子主要见于XDR表型菌株，序列已提交GenBank（收录号PZ914413–PZ914417）。
**3.5 ERIC-PCR指纹多样性与遗传相关性**
ERIC-PCR分析了29株气单胞菌（A. jandaei因仅1株未纳入），物种内指纹谱高度异质。A. caviae菌株AC-127和AC-231形成紧密相关群；A. media菌株AM-049、AM-052和AM-053呈现100%一致的不可区分图谱；A. veronii菌株AV-223和AV-258聚为一簇；A. salmonicida菌株AS-006、AS-008和AS-016具有高遗传相似性，而AS-035指纹谱不同；A. dhakensis的AD-089和AD-180图谱不同，未形成紧密相关群。
**讨论与结论**
讨论指出，HWW中气单胞菌的MDR/XDR高频表型提示该属是医院相关耐药决定因子在环境中的重要储库。头孢菌素和碳青霉烯耐药表型与blaCTX-M group 1、blaSHV、blaKPC家族和blaOXA-48-like的检出基本一致，但PCR结果仅代表基因家族/组水平，未序列确认具体等位变异。1型整合子中未包含β-内酰胺耐药基因盒，但其保留了完整的重组平台，可能在持续抗菌药暴露下捕获新的耐药基因盒，无基因盒整合子的存在值得关注。研究局限性包括样本量较小、物种分布不均、未进行接合试验、质粒分析和全基因组测序，因此不能直接证明水平基因传播或临床传播关联。
研究结论翻译：操作定义的MDR和XDR表型的出现，连同碳青霉烯酶和ESBL相关基因、1型整合子及ERIC-PCR指纹多样性的检测，支持了存在于HWW中的气单胞菌种群作为临床相关抗菌素耐药决定因子环境储库的潜在作用。耐药气单胞菌属与ESKAPE病原体在HWW中的共存支持进一步评估环境细菌作为AMR监测策略潜在组成部分。然而，本研究结果并未证明主动的水平或质粒介导传播，也未建立与临床传播的直接联系；这些方面需使用接合试验和全基因组测序进一步研究。该策略将有助于加深对医院-环境界面抗菌素耐药性环境传播的理解。
