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甲病毒属（Alphavirus）是一个全球性关切，其中一些病毒如基孔肯雅病毒（chikungunya virus）目前正在中国感染数千人，另一些如委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus）可在4
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甲病毒属（Alphavirus）是一个全球性关切，其中一些病毒如基孔肯雅病毒（chikungunya virus）目前正在中国感染数千人，另一些如委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus）可在4%–14%的感染者中诱发神经系统症状。若能获得一种单一抗体，通过对每种病毒分别达到足够的效力，从而对所有感染人类的甲病毒提供保护，则可能具有很高的实用价值，因为届时只需储备单一治疗药物即可应对这一整类新发病原体。研究人员此前鉴定出一种抗体SKT05，具有广谱的脑炎型甲病毒识别能力，同时研究人员还鉴定出能够同时中和致关节炎型和脑炎型甲病毒的纳米抗体（nanobody）。在此，研究人员采用基于结构的设计策略，工程化改造了一种SKT05-纳米抗体双特异性分子，该分子对感染人类的甲病毒具有近泛中和（near pan-neutralization）能力。23种设计的SKT05-纳米抗体双特异性分子广泛中和了表达脑炎型甲病毒包膜蛋白的假病毒（pseudotyped virus）。利用其中10种双特异性分子，研究人员进一步评估了对活体致关节炎型甲病毒——包括马雅罗病毒（Mayaro virus）、奥尼昂尼昂病毒（O’nyong’nyong virus）、罗斯河病毒（Ross River virus）和乌纳病毒（Una virus）——的中和能力，观察到其中4种双特异性分子对所有这些病毒均具有强效中和作用。这4种中效果最佳的一种为V2C3-30-SKT05H，其由V2C3纳米抗体通过30个氨基酸的连接肽（linker）遗传融合至SKT05重链构成，可强效中和所测试的11种甲病毒中的9种，而这些病毒在系统发育上与全部26种感染人类并引起症状的甲病毒密切相关。此外，V2C3-30-SKT05H的治疗性给药降低了基孔肯雅病毒感染小鼠体内的病毒载量。电子显微镜（electron microscopy）揭示，V2C3-30-SKT05H可诱导病毒表面E1E2刺突（spike）的紊乱，提示E1E2解体可能是其中和机制之一。综上所述，这些结果表明一种抗体-纳米抗体双特异性分子实现了对感染人类的甲病毒的近泛中和作用。
论文解读
一、研究背景与科学问题
甲病毒属（Alphavirus）隶属于披膜病毒科（Togaviridae），是一类有包膜、正链单链RNA病毒，主要通过蚊虫传播，对人类和动物健康具有重大影响。根据感染病毒的不同，人类感染甲病毒后可表现为关节炎或脑炎两种临床类型。致关节炎型甲病毒包括罗斯河病毒（Ross River virus, RRV）和基孔肯雅病毒（chikungunya virus, CHIKV），其引起的疫情在范围和频率上均呈上升趋势，尤其在非洲和亚洲多个地区。值得关注的是，2025年中国广东省暴发的CHIKV疫情已感染超过7000人。这些病毒可引起急性和慢性肌肉骨骼疾病，虽罕有致死，但可导致持续数月至数年的顽固性关节疼痛。相比之下，脑炎型甲病毒感染——包括西部、东部和委内瑞拉马脑炎病毒（WEEV、EEEV和VEEV）——的症状可从无症状或急性发热性疾病到严重神经功能损害乃至死亡不等。其中EEEV毒力最强，出现神经侵袭性疾病症状的感染者病死率高达30%–75%；VEEV虽然致死率最低，但就发病率而言可能最为重要，且其疫情可自我维持并达到足以在人类之间进行家养/城市传播的水平。
尽管已有多种疫苗和候选治疗策略被探索用于对抗甲病毒感染，但美国仅批准了少数几种。三种马脑炎病毒均可通过气溶胶途径传播，因此被列为美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）B类优先病原体，其中EEEV和VEEV因具有生物恐怖剂潜力被列为美国农业部/疾控中心选择制剂。自20世纪70年代以来，美国军方一直使用针对各马脑炎病毒的研究性疫苗，但这些疫苗免疫原性差、持久性有限且副作用显著。一种由WEEV、EEEV和VEEV病毒样颗粒（VLP）组成的三价疫苗在非人灵长类（NHP）中展现出良好免疫原性，并可保护其免受三种马脑炎病毒的气溶胶攻击；对接种疫苗的NHP分析鉴定出一种抗体SKT05，可保护VEEV、CHIKV和RRV感染，提示广谱治疗性保护或许是可能的。此外，从免疫羊驼中已鉴定出具有广谱甲病毒中和能力的纳米抗体（nanobody），包括V2B3、V2C3和V3A8f，但迄今尚未鉴定出任何单一抗体或纳米抗体能够实现泛甲病毒中和。
研究人员此前发现，基于抗体-纳米抗体的双特异性分子可提供针对HIV-1的增强中和广度和效力，且在人类FcRn敲入小鼠中具有良好半衰期，生产效率也高于亲本抗体。由此提出科学问题：抗体-纳米抗体双特异性分子能否提供泛甲病毒保护？为回答这一问题，研究人员基于已报道的SKT05抗体及V2B3、V2C3、V3A8f纳米抗体与甲病毒VLP复合物的结构，设计了双特异性抗体-纳米抗体分子。
二、主要技术方法
研究人员采用基于结构的理性设计策略，利用已发表的SKT05-VEEV复合物结构（PDB ID: 8EEU）以及V2B3-VEEV（PDB ID: 9NRX）、V2C3-VEEV（PDB ID: 9NRY）和V3A8f-VEEV（PDB ID: 9NRZ）复合物结构，通过Chimera软件生成完整的T=4二十面体颗粒不对称单元，应用二十面体对称操作生成240个对称相关拷贝，测量纳米抗体与SKT05抗体各末端之间的最短距离，据此选择（ggsgg）n连接肽的重复数范围，将81种可能的组合缩减至23种实用设计。随后利用慢病毒假病毒平台在BSL-2条件下对23种双特异性分子进行脑炎型甲病毒（WEEV、EEEV、VEEV）中和筛选，从中选出10种进一步进行活体致关节炎型甲病毒（ONNV、RRV、UNAV、MAYV）蚀斑减少中和试验（PRNT）评估。对最优候选分子在11种活体甲病毒（涵盖致关节炎型和脑炎型）上进行系统中和评价，并在CHIKV感染小鼠模型中开展治疗性给药实验（C57BL/6J小鼠，4周龄，皮下感染103 FFU CHIKV-LR，感染后1天腹腔注射50 μg抗体或感染后2天注射200 μg）。最后利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术分析V2C3-30-SKT05H的Fab片段（biFAB）与VEEV VLP在不同摩尔比（0.5、1、3 biFAB/刺突）下的结合效应，通过径向密度分析和模型-图谱相关系数评估VLP结构完整性。
三、研究结果
设计纳米抗体-SKT05双特异性分子。 研究人员基于SKT05-VEEV VLP复合物结构（PDB ID: 8EEU），建模补全了缺失的CL和CH1结构域，发现SKT05重链和轻链的N端以及轻链C端均未被抗体-VLP相互作用所占据，适合连接纳米抗体。针对V2B3纳米抗体，测量到5个小于90 ?的距离，其中最短的两个为46 ?（连接V2B3 C端与SKT05重链）和58 ?（连接V2B3 C端与SKT05轻链），据此设计6种构建体。针对V2C3纳米抗体，7个小于90 ?的距离中最短的两个均为51 ?，分别对应V2C3 C端与SKT05重链N端的连接以及SKT05轻链C端与V2C3 N端的连接，据此设计8种构建体。针对V3A8f纳米抗体，最短距离为43 ?（V3A8f C端与SKT05重链N端）和25 ?（SKT05轻链C端与V3A8f N端），据此设计9种构建体。最终共设计23种SKT05-纳米抗体构建体，将组合数从81种缩减至23种。
设计的SKT05-纳米抗体双特异性分子的中和评估。 所有23种双特异性分子及SKT05均能结合VEEV、EEEV和WEEV的VLP。假病毒中和试验显示，对VEEV的中和效果最佳，WEEV次之，EEEV明显较弱。总体上各组合的结合和中和能力相似，但V3A8f连接至SKT05重链的构建体以及SKT05本身对EEEV的中和较弱。从23种中选出10种进行活体致关节炎型甲病毒中和测试，结果显示仅4种双特异性分子具有中和活性，分别为SKT05L-30-V2C3、SKT05L-25-V2C3、V2C3-20-SKT05H和V2C3-30-SKT05H，其中纳米抗体连接至SKT05H的两种构建体对测试甲病毒的蚀斑减少效果最大。亲本SKT05除对RRV有临界中和外，未显示中和活性。
领先双特异性分子对不同甲病毒的广泛中和。 对V2C3-20-SKT05H和V2C3-30-SKT05H两种领先构建体在11种活体甲病毒上进行系统评估。在致关节炎型甲病毒（ONNV、RRV、UNAV、MAYV、SINV、SFV、CHIKV-LR）中，亲本SKT05除SINV外均不能中和；亲本V2C3单价纳米抗体可中和ONNV、RRV、UNAV、MAYV和SFV，对CHIKV-LR仅弱中和，不能中和SINV。相比之下，两种双特异性分子均以IC50 ≤ 0.006 μg/mL的效力强效中和所有测试的致关节炎型甲病毒，仅对SINV为中等中和。在脑炎型甲病毒（EEEV、WEEV、VEEV IAB和VEEV IIIA）中，亲本SKT05和V2C3基本不能中和这些病毒，但双特异性分子——尤其是V2C3-30-SKT05H——展现出中和能力，甚至能中和两种亲本分子均无法中和的EEEV和VEEV IIIA。20-和30-连接肽版本之间的中和效力差异很小，但VEEV IIIA仅30-连接肽版本显示中等中和。相关性分析显示，ELISA结合与假病毒中和之间的相关性总体较低（WEEV: r=0.42, p=0.028；EEEV: r=0.32, p=0.104；VEEV: r=?0.29, p=0.147），但三种脑炎型病毒合并分析时出现强正相关（r=0.59, p<0.0001），表明结合亲和力与假病毒中和仅在较大参数范围内才具有预测关系。活病毒中和与ELISA结合或假病毒中和之间的相关性普遍较低，提示除结合亲和力外的额外病毒或宿主因素制约着活病毒中和。总体而言，V2C3-30-SKT05H对全部11种测试的人类感染甲病毒实现了近泛中和。
三特异性分子评估。 鉴于V2C3-30-SKT05H相对亲本分子增强的中和效力，研究人员通过共转染V2C3-30-SKT05H与SKT05L-25-V3A8f并经蛋白A纯化获得三特异性分子SKT05-V2C3-V3A8f（V2C3连接至SKT05重链N端，V3A8f连接至轻链C端）。该三特异性分子对VEEV的假病毒中和与双特异性分子相似，对WEEV和VEEV IIIA效力约低2倍；对表达SINV非结构蛋白和VEEV或EEEV结构蛋白的嵌合病毒，三特异性分子效力仅小幅增加（约2倍）。总体而言，三特异性分子的中和能力与双特异性分子相当，表明添加第二个纳米抗体未能实现类似程度的效力增强。
11种测试甲病毒对人类感染甲病毒的近泛覆盖。 研究人员汇编了32种已描述甲病毒中26种可感染人类并引起症状的病毒记录，计算了所有引起人类症状的甲病毒与11种测试甲病毒之间的Jukes-Cantor遗传距离（基于E1和E2基因）。结果显示，26种可感染并引起人类症状的甲病毒中有24种与11种测试病毒之一的Jukes-Cantor距离小于0.25，处于该距离估算的可靠范围（0.05–0.3）。仅巴马森林病毒（Barmah Forest virus, BFV）和米德尔堡病毒（Middelburg virus, MIDV）系统发育上更为疏远，距离分别为0.63和0.45，但二者在甲病毒属中代表系统发育上独特的支系，且人类疾病负担记载较少，可能不构成实质性治疗缺口。
V2C3-30-SKT05双特异性分子对CHIKV的体内疗效。 在CHIKV感染小鼠模型中，4周龄C57BL/6J小鼠于后足垫皮下感染103 FFU CHIKV-LR，感染后1天腹腔注射50 μg V2C3-30-SKT05H、SKT05或同型对照抗体，感染后3天安乐死并检测组织病毒载量。结果显示，V2C3-30-SKT05H给药显著降低了同侧踝关节、对侧踝关节、同侧小腿和血清中的病毒载量（与同型对照相比）；而SKT05处理组在同侧踝关节和同侧小腿的病毒载量与同型对照更接近，对侧踝关节和血清中虽有降低趋势但未达统计学显著。在同侧小腿、对侧踝关节和血清中，V2C3-30-SKT05H较SKT05有统计学显著改善。在感染后2天给予200 μg的扩展治疗窗口实验中，V2C3-30-SKT05H较同型对照显著降低CHIKV RNA，但仅在感染后3天的同侧小腿中相对SKT05达到显著差异。总体上，V2C3-30-SKT05H对CHIKV攻击提供了增强的治疗性保护。
V2C3-30-SKT05H双特异性分子破坏VEEV-VLP组织。 冷冻电镜分析显示，当VEEV VLP与V2C3-30-SKT05H biFAB以0.5 biFAB/刺突的摩尔比孵育时，获得5.11 ?分辨率的VEEV VLP结构但未观察到结合的biFAB；在1.0和3.0比例下，VEEV VLP高度紊乱，无法辨别biFAB结构。径向特征分析显示，0.5比例数据集具有对应E1E2刺突（蓝色/浅蓝色）和衣壳蛋白（绿色）的径向特征，而高比例数据集仅能辨别衣壳蛋白特征，E1E2刺突相应径向位置仅见紊乱密度。模型-图谱相关系数方面，0.5比例数据集具有高相关系数，而1.0和3.0比例数据集的相关系数接近零或为负值，表明缺乏结构特征。径向平均密度分析显示E1E2刺突三聚体径向位置处静电势分布发生改变。这些数据表明存在一个陡峭的化学计量边界（介于0.5和1摩尔之间），在此边界上V2C3-30-SKT05H诱导E1E2刺突紊乱，这种紊乱为该设计双特异性分子的强效中和提供了潜在解释。
四、讨论与结论
本研究表明，将纳米抗体V2C3连接至抗体SKT05重链构建的抗体-纳米抗体双特异性分子V2C3-30-SKT05H，实现了对感染人类的甲病毒的近泛中和。研究中采用的慢病毒假病毒平台虽然在BSL-2条件下支持高通量初筛（从23种缩减至10种），但假病毒中和与活病毒中和之间的相关性总体较弱，因此研究人员以活病毒验证作为优先策略鉴定最有效的双特异性分子。值得注意的是，基于亲本抗体中和能力无法预测的广泛而强效的活病毒中和——尤其是VEEV-IIIA和EEEV——是出乎意料的。SKT05本身虽无活病毒中和活性但可通过Fc依赖性机制提供保护，而V2C3-30-SKT05H保留了SKT05的Fc功能并同时通过V2C3-30-SKT05H介导的E1E2刺突解体获得直接中和能力，这种Fc依赖性免疫激活与直接中和的双重机制组合很可能解释了其优于单独SKT05的体内疗效。
在假病毒中和中三种纳米抗体活性相似，但在活病毒中和中仅V2C3纳米抗体（以两种不同格式连接）显示强效活性，提示对最佳抗体和纳米抗体的双特异性组合进行实验筛选是有价值的。V2C3-30-SKT05H的强效中和似乎源于其在低抗体-刺突比例下诱导三聚体紊乱的能力，这种紊乱是仅含SKT05的Fab所不能观察到的，归因于双特异性分子的双表位结合能力。
在制造方面，抗体-纳米抗体双特异性分子通过将纳米抗体附加至抗体的一条链上，保留了亲本抗体的单重链和单轻链结构，仅其中一条链被修饰以添加纳米抗体，从而简化了制造过程。研究人员此前制造的CAP256.J3LS抗体-纳米抗体双特异性分子表达产量约2 g/L，高于亲本抗体本身，且在人类FcRn敲入小鼠中的半衰期优于任一亲本分子。
V2C3-30-SKT05H的系统发育广度——中和了跨越四个不同抗原复合物的11/11测试甲病毒——证明针对这一具有挑战性的病毒家族实现泛反应性治疗抗体是可行的。该广度涵盖了全球甲病毒疾病负担的主要病原体，包括CHIKV、RRV、MAYV和VEEV。该双特异性分子在CHIKV小鼠模型中的体内疗效验证了体外中和广度可转化为保护能力。这些发现表明，互补表位的理性组合可以克服历史上限制单一抗体疗法广度的甲病毒抗原复杂性。
