吞噬屏蔽型BaEVRLess假型逆转录病毒载体系统递送实现体内造血干细胞基因治疗镰状细胞病

《Cell Stem Cell》：Systemic delivery of phagocytosis-shielded retroviral vectors enables in vivo HSC gene therapy for sickle cell disease

　　

离体造血干细胞（HSC）基因治疗对于包括镰状细胞病（SCD）在内的非恶性血液疾病是有效的，但该方法需要住院治疗、离体细胞操作以及清髓预处理。直接的体内基因递送可以消除这些障碍并扩大治疗的可及性。在本研究中，研究人员探索了以狒狒内源性逆转录病毒糖蛋白变体BaEVRLess假型化的吞噬屏蔽型慢病毒载体和α逆转录病毒载体用于体内HSC基因转移。将载体注射至经动员的人源化小鼠后，hCD45⁺细胞中的基因标记率可达8.8%，经化学选择后富集至hCD45⁺细胞的70%和HSC的54%。条形码分析显示，超过90%的小鼠呈现多克隆重建，且在二次移植受体中保持稳定。针对SCD，研究人员利用miRNA嵌入型短发夹RNA（shmiR）在红系细胞中特异性靶向BCL11A和ZNF410以去抑制γ-珠蛋白表达，达到了61.5%的β样珠蛋白的治疗相关水平。总之，BaEVRLess假型慢病毒载体可实现具有临床意义的体内基因转移和用于SCD的胎儿珠蛋白诱导。

**论文解读文章**

镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）是一种由β-珠蛋白基因点突变引起的严重单基因遗传病，全球患者超过700万，主要分布于非洲和印度。当前SCD的根治性治疗选择包括异基因造血干细胞移植（HSCT）和基于自体细胞的离体HSC基因治疗。然而，HSCT仅对约15%的患者可行，且存在移植物抗宿主病（GvHD）等显著风险；离体基因治疗虽已获FDA批准（如Lyfgenia和Casgevy），但其复杂的离体细胞制造流程、高昂的成本及清髓预处理相关风险严重限制了可及性。因此，开发可通过简单静脉注射实现的体内HSC基因递送策略，有望克服上述瓶颈，使基因治疗更安全、经济且可广泛推广。然而，体内HSC基因递送面临多重挑战：载体需高效转导非分裂期的静止态HSC、抵抗先天免疫系统的清除、具备安全的整合谱，且不受既有免疫的干扰。基于此，研究人员开展了本项研究，系统评估了吞噬屏蔽型BaEVRLess假型逆转录病毒载体在体内进行HSC基因递送并治疗SCD的可行性与疗效。该研究成果发表于《Cell Stem Cell》。

研究人员采用人源化NBSGW小鼠模型（NOD.B6.SCID Il2rγ^-/- kit^W41/W41），以健康成人供者动员外周血（mPB）来源的CD34⁺ HSPC进行异种移植。关键技术方法包括：比较不同病毒包膜糖蛋白（VSVg、BaEVTR、BaEVRLess、RD114TR）假型化载体的转导效率与血清稳定性；通过CD47过表达实现吞噬屏蔽；利用AMD3100联合Gro-beta方案动员HSC至外周血；借助MGMT-P140K突变体甲基转移酶基因介导的BCNU/O6-BG化学选择系统富集基因标记细胞；采用UMI条形码技术结合二代测序评估克隆多样性；并通过体外红系分化及RT-qPCR定量γ-珠蛋白表达水平。

研究结果主要包括以下六个方面：

**（1）BaEVRLess假型α逆转录病毒载体具有血清抗性并能高效转导CD34⁺ HSPC。** 研究人员通过体外实验比较了不同包膜糖蛋白的特性，发现BaEVRLess假型载体在HEK293T细胞上的滴度比BaEVTR和RD114TR高约1个对数级；在含Vectofusin-1或Retronectin的条件下，对预刺激CD34⁺ HSPC的转导率达70%–80%，优于VSVg。更为关键的是，在无细胞因子条件下对静止态CD34⁺ HSPC转导时，BaEVRLess假型载体达到27.6%的基因标记率，而VSVg仅2.4%。新鲜人血清中和实验证实BaEVRLess对补体介导的灭活具有抵抗性，而VSVg则部分被中和。

**（2）慢病毒和α逆转录病毒载体均可实现CD34⁺ HSPC的体内转导。** 在NBSGW小鼠共注射实验中，MOI 100是获得可检测基因标记所需的剂量；CD47过表达使骨髓中的基因标记率提高5倍；竞争性共注射实验显示，在依据离体转导率归一化后，慢病毒与α逆转录病毒载体的体内转导效率无显著差异，且各造血谱系间基因标记分布一致。

**（3）AMD3100联合Gro-beta可高效动员人源化NBSGW小鼠。** 研究人员系统比较了三种动员方案，发现AMD3100+Gro-beta方案使外周血中人CD45⁺细胞比例自基线8.5%升至60.2%，Lin^?CD34⁺ HSPC绝对数量增加11.3倍，且约71%的动员HSPC处于G0期。此外，动员后注射载体可使基因标记率提高1.7倍，并维持长时间稳定。序贯给药方案相较于同时给药展现出更高的循环CFU数量。

**（4）连续移植证实了体内转导的原始HSPC具备长期重建能力。** 经体内转导和BCNU化学选择后，原代受体骨髓基因标记率达8.7%，二次移植后平均升至58.5%。条形码分析在原代受体中检测到平均1280个独特条形码，二次受体中维持523个，Shannon多样性指数分别为2.2和1.7，超过25%的条形码在二次受体中重现，证明转导发生于具有自我更新能力的长期重建HSC。

**（5）供体嵌合率和HSPC动员效率是决定基因标记率与克隆多样性的关键参数。** 研究人员通过递增CD34⁺细胞移植剂量（62,500至500,000）建立了不同人源化水平的小鼠模型。结果显示，动员后Lin^?CD34⁺ HSPC数量与早期基因标记率呈正相关（R2=0.9），与他人源化水平更高的动物在化学选择后骨髓基因标记率达13%–32%，且保持多克隆造血。

**（6）治疗性SCD载体可实现强健的HbF诱导。** 研究人员构建了共表达MGMT-P140K/EGFP以及红系特异性双shmiR（靶向BCL11A和ZNF410）的治疗性慢病毒载体。在优化条件下，外周血基因标记率从第1周的约4%升至第16周的69.5%，骨髓hCD45⁺细胞基因标记率达69.1%，其中HSPC的标记率为53.7%。体外红系分化后检测显示，γ-珠蛋白mRNA水平从第10周的34.9%升至第16周的61.5%，达到预防镰变的治疗相关阈值。

在讨论部分，研究人员指出，体内基因递送结合MGMT-P140K化学选择是本策略实现治疗性疗效的核心。虽然BCNU选择存在继发恶性肿瘤和不育等风险，但该研究证实了化学选择可在富集基因标记细胞的同时维持多克隆造血。研究人员强调，动员后循环HSPC数量是体内转导效率的首要限速变量，这提示动员方案的优化与载体工程同等重要。关于载体的选择，慢病毒与α逆转录病毒在体内表现相当，后者因近随机整合模式和缺少载体编码的剪接供体/受体信号而具备更优的安全谱，且支持稳定生产细胞系的建立。研究还讨论了非基因毒性选择策略（如抗体-药物偶联物靶向表位编辑的表面抗原）和受体定向载体靶向（如cKit或CD90）作为未来消除选择依赖的可能方向。鉴于BaEVRLess本身缺乏细胞类型特异性，红系特异性调控元件提供的转录层面靶向控制对于限制脱靶效应至关重要。

**研究结论：** 本研究证实，吞噬屏蔽型BaEVRLess假型慢病毒载体可通过简单静脉注射实现人源化小鼠体内长期重建HSC的高效基因转移。结合AMD3100/Gro-beta动员和MGMT-P140K化学选择，治疗后基因标记率可达hCD45⁺细胞的约70%及HSPC的54%，同时维持多克隆造血。通过红系特异性shmiR靶向BCL11A和ZNF410，γ-珠蛋白表达达到61.5%的β样珠蛋白占比，可有效抑制镰变。该策略无需离体细胞操作和清髓预处理，为SCD及其他血红蛋白病的体内基因治疗提供了具有临床转化潜力的新范式。