煤层中潜在自养微生物的发现：地下煤层微生物组的表征、富集与基因组解析代谢

《Applied and Environmental Microbiology》：Uncovering potential autotrophs in coal seams: characterization, enrichment, and genome-resolved metabolisms of a subsurface coal seam microbiome

　　

无机碳向有机化合物的生物转化是一个极其重要的生物合成过程，许多生物通过自养方式催化这一反应，以CO2作为唯一碳源。自然界中的自养途径多种多样，利用这些途径的生物也各不相同，这在一定程度上受到它们所栖息的多样化生态位驱动。煤层是一个尚未被充分研究的生态位，其中含有自养产乙酸菌，它们催化煤转化为甲烷的中间步骤。本研究对阿巴拉契亚盆地煤层产出水（CSPW）的地球化学和微生物学进行了表征，并通过在H2:CO2条件下持续进行厌氧富集，证明了其生长增强和乙酸盐产量增加。具体而言，富集的CSPW微生物组由Proteiniphilum、Proteiniclasticum、Gudongella、Acetobacterium、Propionicimonas和Mesobacillus组成。基因组解析代谢揭示了六种潜在的自养途径，包括四种天然途径（还原性戊糖磷酸途径、逆氧化三羧酸循环、还原性乙酰辅酶A途径和还原性甘氨酸途径）和两种提出的合成途径（丝氨酸-苏氨酸循环和丙酮酸甲酸裂解酶-苏氨酸循环），许多宏基因组组装基因组编码了多条途径。总体而言，这些发现表明了一种精细且适应性强的碳转化策略，揭示了煤层中的碳反应，以及利用混合微生物群落生物生产有价值化学品/燃料的潜在应用。

研究背景与意义

碳固定是全球碳循环的关键环节。生物圈中大部分无机碳通过还原性戊糖磷酸途径（即卡尔文-本森-巴沙姆循环，CBB循环）转化为有机物，但自然界中也存在多种替代性自养途径，包括逆三羧酸循环（rTCA）、还原性乙酰辅酶A途径（Wood-Ljungdahl途径，WLP）、还原性甘氨酸途径（rGlyP）、二羧酸-4-羟基丁酸循环（DC/4HB）、3-羟基丙酸-4-羟基丁酸循环（3HP/4HB）、3-羟基丙酸双循环（3HP）、丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径（RuMP）、木酮糖单磷酸途径（XuMP）以及逆氧化三羧酸循环（roTCA）。这些途径在细菌和古菌域中的分类分布比以往认为的更广泛，揭示了此前未知的分类群可能是各种生态系统中碳转化的潜在贡献者。

煤层及其他能源相关环境代表了未充分利用的CO₂转化微生物资源，并对全球碳循环具有潜在但尚未被充分认识的影响。全球范围内已有大量针对煤层微生物的表征研究，尤其是它们将煤自然转化为甲烷的能力，这对于提高煤层甲烷产量（作为燃烧煤炭获取能源的替代方案）至关重要。在此框架下，煤中间产物（如长链脂肪酸）被降解为氢气和二氧化碳，随后分别通过产乙酸菌或氢营养型产甲烷菌转化为乙酸盐或甲烷。尽管在煤层地下常见的较低CO₂和H₂浓度下，氢营养型产甲烷作用在能量上更有利，但产乙酸菌可能仍发挥着重要但未被充分认识的作用。

CO₂-产品技术可将废弃碳从闲置来源转化为有价值的燃料/化学品，包括电化学转化、热/化学转化（费托合成）和生物转化。非生物途径的直接CO₂还原需要高能量输入（如高温高压）、产物选择性低且产物谱有限，通常局限于单碳输出。相比之下，生物CO₂转化技术利用微生物在常压和近常温条件下捕获和利用气态一碳化合物（C1）以产生更长链分子的天然能力。通过适当的工程控制和反应器设计，以及非天然途径的表达，CO₂可以以高速率和滴度被生物转化为更高价值的化合物。

基于此，研究人员对阿巴拉契亚盆地的三口煤层井进行了地球化学和微生物学表征。通过对煤层产出水（CSPW）的持续厌氧富集，揭示了一个能够通过碳固定生长并产生乙酸盐的混合微生物群落。通过16S rRNA基因扩增子测序和宏基因组测序，研究人员鉴定出六个主要分类群，每个都编码了多种碳固定途径。这些途径在所述分类群中此前未被表征，从而扩展了对微生物碳利用策略的认识。在某些情况下，同一微生物中编码了多条碳固定途径，暗示了一种更为精细和适应性更强的碳代谢。这项工作表明，煤层代表了一种未充分利用的生物CO₂转化技术微生物资源，并有助于更好地理解它们在深层地下能源系统中碳转化中的作用。

关键技术方法

研究人员从美国宾夕法尼亚州西南部三口煤层甲烷井（命名为NV57、NV65和NV73）采集产出水作为接种物。采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定主要和微量阳离子。对原始煤层微生物组进行宏基因组测序（Illumina MiSeq平台，2 × 300 bp双端测序）。通过16S rRNA基因扩增子测序（V4区域，引物515F/806R）和QIIME2流程进行群落结构分析。宏基因组数据经Trimmomatic修剪后，使用metaSPAdes组装，MaxBin2分箱获得宏基因组组装基因组（MAG），CheckM评估质量，GTDB-tk进行分类学分配。MAG通过RASTtk管道注释，针对所有已知自养途径的酶进行检索，并使用BLASTp比对NCBI非冗余数据库确认。

研究结果

1. 未经富集的煤层产出水的地球化学与微生物学表征

研究人员对来自阿巴拉契亚盆地的煤层产出水进行了现场和实验室流体化学分析。总溶解固体（TDS）范围为8.71 g/L至32.14 g/L，pH值呈中性至微碱性（6.58-8.09），地球化学特征与该区域先前采样的煤层甲烷井相似。16S rRNA基因扩增子测序显示样品分类多样性丰富，相对丰度最高的微生物属于Acetobacterium、Methanocalculus、Fermentibacteraceae、Methanobacterium和Smithella。宏基因组读段的分类学分析显示，甲烷微菌目（Methanomicrobiales）和真杆菌目（Eubacteriales）占优势，这与阿巴拉契亚盆地其他煤层宏基因组相似，但与其他地理区域的煤层微生物种群明显不同。值得注意的是，NV57和NV73样品中分别有33%和70%的宏基因组读段未被分类，表明这些样品中很大一部分潜在多样性是新颖的和/或未被记录的。

2. CSPW微生物组的富集

为富集自养微生物，研究人员将未过滤的CSPW接种到四种不同的培养基中，并以H₂:CO₂（80:20）供气。最佳生长出现在碳酸氢盐缓冲培养基（ATCC 1019和DSMZ 135）中，而FW最低培养基或磷酸盐培养基中几乎无生长。来自井NV65的富集物达到了最高光密度，被选作进一步测试。对搅拌、温度和酵母提取物（YE）浓度的测试表明，搅拌（200 rpm）对生长和乙酸盐滴度有积极影响；30°C下的孵育产生了最快的生长和最高的乙酸盐滴度；YE的添加促进了生长速率和乙酸盐滴度的增加。16S rRNA基因扩增子测序显示，所有样品主要由以下分类群组成（>1%相对丰度）：Peptostreptococcales-Tissierellales、Proteiniclasticum、Desulfosporosinus、Fermentimonas和Acetobacterium。在25°C和30°C下，Peptostreptococcales-Tissierellales在所有YE浓度下均具有最高相对丰度（64.9%-89.6%）。

3. 碳酸氢钠是生长和产物形成的必要条件

研究人员检测了一系列碳酸氢钠（NaHCO₃）浓度（0、2.5、5和10 g/L）对其效果的影响。无NaHCO₃的培养物表现出最小生长（OD₆₀₀ = 0.1），产生少量乙酸盐（约41-164 mg/L）。随着NaHCO₃的增加，生长和乙酸盐产量显著提升：2.5 g/L时OD达到0.549，乙酸盐产量约1.11 g/L；5 g/L时OD为0.769，乙酸盐1.29 g/L；10 g/L时OD为0.739，乙酸盐1.44 g/L。较高的NaHCO₃导致更高的pH、细胞生长和乙酸盐产量，表明NaHCO₃既可作为pH缓冲剂，也可作为无机碳源。主要分类群的相对丰度随NaHCO₃浓度变化，Peptostreptococcales-Tissierellales在5或10 g/L NaHCO₃的富集中占主导地位（50%-77%），而在0 g/L时则以Bacillus为主（45%-85%）。

4. 更大体积和更长时间下的CSPW微生物组

研究人员将批次反应器从20 mL放大至1 L（500 mL工作体积），以半批次模式运行30天。微生物生长在前几天最快，之后减缓。前7天内，反应器产生了2.23和3.03 g/L的乙酸盐，30天后乙酸盐滴度达到5.52和6.19 g/L。乙酸盐产率在前4天最高（0.582 g/L/天），30天平均为0.184 g/L/天。甲酸盐在不同时间点积累，在第5至10天之间出现最高峰值，对应生长速率减慢和乙酸盐产量停滞，表明甲酸盐可能是潜在中间产物。群落组成以Fermentimonas、Proteiniclasticum、Peptostreptococcales-Tissierellales、Acetobacterium和Bacillus为主，尽管各反应器间相对丰度存在差异，但在生长、pH和乙酸盐产量方面未观察到重大差异，表明群落成员间存在潜在的代谢重叠。

5. 氢气增强生长和乙酸盐产量

研究人员使用各种纯气体和混合气体检测了CSPW微生物组的生长和有机酸产量。含氢气体（H₂:CO₂、H₂、H₂:CO₂:CO混合物）产生的生长最旺盛（最大OD为1-1.25），乙酸盐产量最高（最高1.2 g/L）。相比之下，CO₂、N₂、N₂:CO₂和CO条件下的OD范围仅为0.45-0.52。无论气体成分如何，主要分类群仍然存在，但相对丰度有所变化。含CO的实验显示出明显不同的群落结构，包括芽孢杆菌科（Bacillaceae）比例升高和Peptostreptococcales-Tissierellales比例降低。总体而言，含氢气体产生了最高的生长和乙酸盐滴度，即使在存在一氧化碳的情况下也是如此，表明合成气可用作气态原料。

6. 富集CSPW微生物组的表征与宏基因组组装基因组质量评估

研究人员对H₂:CO₂反应器的第1、15/16和30天样品进行了宏基因组测序。通过组装和分箱，从所有样品中获得了六个不同细菌属的MAG，包括四种厚壁菌门（Gudongella、Proteiniclasticum、Acetobacterium和Mesobacillus）、一种拟杆菌门（Proteiniphilum）和一种放线菌门（Propionicimonas）。大多数MAG的完整性超过88%，污染率低于2%。约98%的双端宏基因组读段映射到生成的MAG，表明MAG充分代表了宏基因组。值得注意的是，16S rRNA基因扩增子测序发现了Fermentimonas和Peptostreptococcales-Tissierellales，但宏基因组数据中未发现Fermentimonas，而是发现了与其密切相关的Proteiniphilum；Peptostreptococcales-Tissierellales很可能对应于属于Tissierellaceae科的Gudongella。同一属的MAG在整个实验过程中都存在，全基因组比较（平均核苷酸同源性）显示跨样品的相似性>99%。

7. 自养途径的基因组解析代谢

研究人员在CSPW的MAG中调查了所有已知的自养途径，发现了六种可能运作的途径，包括四种已知的天然途径——还原性戊糖磷酸途径（CBB循环）、逆氧化三羧酸循环（roTCA）、还原性乙酰辅酶A途径（WLP）和还原性甘氨酸途径（rGlyP）——以及两种提出的合成途径——丝氨酸-苏氨酸循环（SerThrCyc）和丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）-苏氨酸循环（PFL-ThrCyc）。CBB循环的关键酶RubisCO和磷酸核酮糖激酶（PRK）仅在Propionicimonas MAG中发现。roTCA循环可能在Proteiniphilum、Propionicimonas和Mesobacillus MAG中运作，因为它们编码了柠檬酸合酶和2-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。WLP仅在Acetobacterium MAG中被发现，它编码了完整的甲基分支和羰基分支，但甲酸脱氢酶簇与A. woodii明显不同。rGlyP是最普遍的途径，所有MAG都编码了核心模块和丝氨酸变体，但只有Gudongella MAG编码了甘氨酸还原酶变体。SerThrCyc由Proteiniclasticum、Gudongella和Mesobacillus MAG编码，而PFL-ThrCyc由Proteiniclasticum和Mesobacillus MAG编码。

讨论与结论

讨论部分指出，煤层蕴藏着代谢多样的微生物网络，这种多样性在不同煤盆地乃至同一盆地的样品中均可观察到。本研究中，样品NV65含有约4%的相对丰度的已知产甲烷菌，但在富集微生物组中未检测到，可能是由于无意中的氧气暴露抑制了产甲烷菌生长，和/或培养基成分有利于观察到的六个细菌类群的生长。多项证据表明气态H₂和CO₂正被CSPW微生物组消耗，包括大型反应器中观察到的强负压，以及供应氢气时光密度和乙酸盐产量最高，表明CO₂固定需要H₂作为还原剂。酵母提取物（YE）提供了必需的氨基酸，因为许多MAG未编码特定的氨基酸生物合成途径，而Stickland发酵的存在可能有助于支持氨基酸上的生长。虽然较高YE浓度增加了生长和乙酸盐滴度，但只需最少的YE即可实现碳转化，表明在营养贫乏条件下（如煤层）碳转化是可能的。CSPW微生物组内的碳转化可能复杂而精细，多个微生物通过多条途径参与碳固定。许多MAG编码了多条自养途径，这可能功能性地协同增强CO₂消耗和细胞生长速率，或在动态环境中维持高碳反应速率发挥互补作用。

研究结论：总之，研究人员提供了阿巴拉契亚盆地CSPW的地球化学和微生物学表征，并通过选择性富集，鉴定出一个独特的微生物组合，能够利用二氧化碳/碳酸氢盐生长并产生乙酸盐。从宏基因组组装基因组中鉴定出多条自养途径，揭示了还原性甘氨酸途径、还原性乙酰辅酶A途径、逆氧化三羧酸循环、卡尔文-本森-巴沙姆循环、丝氨酸-苏氨酸循环和/或PFL-苏氨酸循环的潜在运作。有趣的是，许多微生物编码了多条自养途径，表明了适应性强的碳转化策略。总体而言，这些发现揭示了煤层中潜在的自养机制，并为生物碳转化技术的发展提供了框架。