鼻内二价疫苗诱导抗原特异性体液免疫与Th1/Th17细胞免疫并保护幼年和老年小鼠抵抗MRSA及铜绿假单胞菌皮肤软组织感染

《Infection and Immunity》：An intranasal bivalent vaccine induces antigen-specific humoral and Th1/Th17 cellular immunity and protects young and aged mice against MRSA and Pseudomonas aeruginosa skin and soft tissue infections

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, SA）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是ESKAPE病原体，可引起严重的皮肤及软组织感染（skin and soft tissue infections, SSTIs），尤其是在老年人和免疫功能低下人群中。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus, MRSA）和耐碳青霉烯类PA感染率的不断上升使标准抗生素的疗效降低。遗憾的是，目前针对这两种病原体均无已获批的疫苗。为满足这一需求，研究人员开发了一种二价鼻内（intranasal, IN）疫苗制剂，将L-PaF（PA III型分泌系统蛋白PcrV和PopB的融合蛋白）与黏膜佐剂LTA1、NEAT2（N2）（SA IsdB蛋白的保护性血红素转运结构域）以及一种新型TLR-4激动剂——一种脱毒脂质A类似物，命名为细菌酶组合化学438（Bacterial Enzymatic Combinatorial Chemistry 438, BECC₄₃₈b）——组合，配制成水包油medImmune乳剂（medImmune emulsion, ME）。经L-PaF/ME/N2/BECC₄₃₈b免疫的小鼠产生了强效的抗原特异性IgG和IgA应答，并与对MRSA和PA菌株的强效调理吞噬杀伤（opsonophagocytic killing）相关。疫苗接种还诱导了幼年和老年小鼠脾细胞中的白细胞介素（interleukin, IL）-17A、IL-2和IL-22应答，支持Th1/Th17介导的免疫。在严格的鼠类SSTI模型中，免疫动物表现出皮肤坏死（dermonecrosis）、脓肿体积和细菌负荷显著降低，与非免疫对照相比，脓肿菌落形成单位（colony-forming units, CFU）减少约10倍。值得注意的是，尽管存在年龄相关的免疫衰老（immunosenescence），幼年和老年小鼠均观察到显著保护作用，其中老年疫苗接种动物的脓肿形成和细菌负荷相对于非免疫对照显著减少。这些结果表明，二价L-PaF/ME/N2/BECC₄₃₈b制剂有望成为针对不同年龄组MRSA和PA介导的SSTI的广谱疫苗。

**研究背景与意义**

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, SA）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是ESKAPE病原体中的重要成员，是皮肤及软组织感染（skin and soft tissue infections, SSTIs）的主要致病原，尤其对老年人和免疫功能低下人群构成严重威胁。流行病学数据显示，2001至2009年间SA相关SSTI住院率从每10万人57例增至117例，75岁以上老年人住院率高达每10万人327例；PA感染中约32.7%源自皮肤软组织来源，老年住院患者中约29.9%的PA分离株为耐碳青霉烯菌株。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus, MRSA）和耐碳青霉烯PA的持续蔓延严重削弱了标准抗生素的疗效，而针对这两种病原体目前均无获批疫苗。此前的MRSA疫苗候选物（StaphVAX和V710）在人体试验中均未能展示保护效力，其原因包括抗原选择不佳及未使用佐剂导致IL-17应答不足；PA疫苗研发也均未获监管批准。鉴于感染负担沉重、耐药形势严峻且疫苗需求迫切，研究人员在本研究中将PA保护性抗原L-PaF（PcrV和PopB的融合蛋白）与SA的保护性N2结构域（IsdB蛋白的血红素转运结构域）组合，并加入新型TLR-4激动剂BECC₄₃₈b（一种脱毒脂质A类似物）和黏膜佐剂LTA1，构建了双价鼻内疫苗制剂，系统评估其在幼年和老年小鼠中的免疫原性与保护效力。

**研究内容与总体结论**

研究人员制备了四种不同N2（5 μg或10 μg）与BECC₄₃₈b（0.5 μg或1.0 μg）剂量组合的L-PaF/ME/N2/BECC₄₃₈b制剂，以两周间隔鼻内免疫C57BL/6幼年（6–8周龄）和老年（18月龄）小鼠三次，从体液免疫、细胞免疫和攻毒保护三个层面进行了全面评估。结果表明，该疫苗平台可诱导显著的抗原特异性IgG/IgA应答、功能性的调理吞噬杀伤（opsonophagocytic killing, OPK）活性以及Th1/Th17型细胞免疫，并在严苛的MRSA和PA皮下感染模型中显著减轻皮肤坏死、脓肿形成和细菌负荷。值得注意的是，老年小鼠尽管存在年龄相关的免疫衰老（immunosenescence），仍保留了有意义的保护效果。综合各项指标，L-PaF/ME/N2 10 μg/BECC₄₃₈b 0.5 μg被确定为先导候选制剂。

**关键技术方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）重组蛋白制备：在大肠杆菌中表达L-PaF/His-PcrH复合物和His-N2，经固定化金属亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤