PgaR调控肺炎克雷伯菌pgaABCD操纵子介导的聚-N-乙酰葡糖胺生物合成及其对毒力的影响

《Infection and Immunity》：PgaR is a positive regulator of the pgaABCD biosynthetic operon in Klebsiella pneumoniae

　　

编码胞外多糖聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG）的生物合成基因座在细菌中广泛保守，包括世界卫生组织关键优先级病原体肺炎克雷伯菌（Kp）。在Kp中，PNAG的合成由pgaABCD操纵子介导，但其谱系特异性调控仍不完全清楚。研究人员采用比较基因组学方法，在高风险克隆Kp复合体258（CC258）谱系中探究pgaABCD基因座，发现了一个位于pgaA上游、此前未被鉴定的正性转录调控因子，将其命名为pgaR。系统发育分析揭示了影响该调控区的反复进化事件，包括pgaR的重复缺失或截短，以及pgaR起始密码子上游的一个G>A替换。功能鉴定表明，pgaR的缺失会废除pgaABCD的表达和PNAG的产生，而上游的G>A替换则驱动PNAG超量产生。在体外生长条件下，Kp产生广泛的胞外PNAG网络。研究人员利用原型高毒力株在体内模拟PNAG的作用，发现在小鼠肺炎和腹膜炎模型中，PNAG对毒力并非必需。相反，PNAG超量产生显著减弱了毒力并降低了疾病严重程度。综上，这些发现将PgaR鉴定为pgaABCD操纵子的一个新上游基因调控因子，并揭示了Kp中一个此前未被识别的谱系特异性PNAG调控层面。这表明，相反的PNAG表型（即丧失和超量产生）已在临床CC258分离株中独立且反复出现，凸显了作用于该基因座的选择压力。

肺炎克雷伯菌PNAG调控机制与毒力关系的系统解读

研究背景与科学问题

聚-N-乙酰葡糖胺（Poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG）是一种由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）经β(1-6)糖苷键连接而成的高分子量细菌胞外多糖，广泛存在于多种细菌中，包括世界卫生组织（WHO）关键和高优先级病原体清单中的多数成员。与其他细菌表面分子（如脂多糖LPS的O抗原）具有物种特异性不同，PNAG在共生菌和致病菌中均高度保守，因此被视为极具潜力的抗感染治疗靶点。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, Kp）是人体微生物组的常见组分，可定植于口咽部和胃肠道黏膜表面。经典Kp（cKp）主要感染免疫功能低下患者，常引起细菌性肺炎和血流感染，并与广泛抗菌药物耐药性相关。其中，耐碳青霉烯类和第三代头孢菌素类抗生素的cKp感染尤为棘手，已被WHO列为关键优先级病原体。克隆复合体258（Clonal Complex 258, CC258）是一个全球分布的高风险谱系，包含序列型11（Sequence Type 11, ST11）、ST258和ST512，是碳青霉烯耐药性在cKp中传播的主要驱动力。与此相对，高毒力Kp（hypervirulent Kp, hvKp）可引起社区获得性感染，甚至感染健康个体，其特点是荚膜多糖（Capsular Polysaccharide, CPS）过度产生和携带大型毒力质粒。

在革兰氏阴性菌中，PNAG合成由四基因操纵子pgaABCD编码。PgaC（糖基转移酶）与辅助蛋白PgaD形成内膜复合物，聚合UDP-GlcNAc生成完全乙酰化的PNAG聚合物；该聚合物延伸至周质空间后，由脱乙酰酶PgaB去除约10%的乙酰基团，以便通过外膜孔蛋白PgaA输出。尽管pgaABCD基因座在Kp基因组中普遍存在，但其基因序列在不同Kp菌株间的保守性尚未被系统研究。此外，虽然免疫荧光染色已成功用于可视化多种细菌表面的PNAG，但在Kp上的尝试却未得到明确结果。

PNAG也被认为是多种细菌病原体的已知毒力因子。例如，从Kp菌株CG43S中敲除pgaC会导致口服接种后胃肠道定植能力下降，且腹腔注射途径给药时毒力也降低。此外，使用PNAG特异性单克隆抗体F598或多克隆血清进行预防性治疗可保护小鼠免受腹腔Kp攻击。然而，PNAG在其他感染部位（如肺炎和血流感染，Kp在这些部位是致死的主要原因）对Kp毒力的贡献尚不清楚。

本研究旨在解决以下核心科学问题：Kp中是否存在PNAG特异性调控因子？PNAG在Kp中的产生方式及其结构特征如何？PNAG在不同感染模型中对毒力的贡献是什么？CC258谱系中PNAG相关突变如何演化？

关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：

1. 1.
   比较基因组学与系统发育分析：收集了9214个公开可用的CC258基因组，通过与ST11参考基因组HS11286比对构建染色体比对图谱，使用Gubbins v3.2.1去除重组区域并构建最大似然系统发育树，再采用最大简约法进行祖先状态重建，推断每个碱基位点在系统发育树上的状态变化次数。
2. 2.
   免疫荧光（IF）染色与定量：使用PNAG特异性单克隆抗体F598对静态生长的Kp进行染色，结合膜染料FM464可视化细菌，通过Zeiss Axio Observer Z1显微镜成像并使用FIJI软件计算平均荧光强度（MFI）。
3. 3.
   全细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）：直接在细菌包被的微孔板中使用F598检测PNAG总量。
4. 4.
   定量实时PCR（qRT-PCR）：提取静态生长后粘附Kp的RNA，反转录为cDNA后使用SYBR Green检测pgaR、pgaC和看家基因rho的转录水平。
5. 5.
   动物感染模型：使用CD-1小鼠气管插管（IT）建立严重肺部感染模型，使用BALB/c小鼠腹腔注射（IP）建立腹膜炎模型，在特定时间点评估体重变化、肺/腹腔和血液中的细菌载量。

研究结果

Kp产生胞外PNAG网络

研究人员通过IF染色和ELISA对野生型（WT）ICC8001（Kp_WT）和pgaBCD开放阅读框缺失突变体（ΔpgaBCD）进行检测。结果显示，Kp_WT在静态生长条件下产生了弥散的胞外PNAG网络，常在粘附细胞间形成长纤维结构；而ΔpgaBCD则完全检测不到PNAG。定量分析证实Kp_WT包被孔的MFI和ELISA吸光度均显著高于ΔpgaBCD。进一步对100株跨越19年收集的多样化Kp临床分离株进行检测，发现尽管所有菌株都编码完整的pga基因座，但只有91株检测到PNAG，且在所有阳性案例中PNAG均呈现为胞外网络形式。这证实了胞外PNAG网络形成是不同Kp菌株间保守的表型。

PNAG在Kp肺部感染期间体内产生

研究人员使用高毒力株ICC8001及其等基因ΔpgaBCD突变体感染CD-1小鼠，在感染后72小时通过IF染色观察肺切片。结果显示，Kp_WT感染的肺组织中在Kp富集的背侧区域检测到强烈的PNAG信号，而ΔpgaBCD感染的肺组织则无PNAG染色。进一步观察发现，体内PNAG同时以胞外网络和细胞相关两种形式存在：胞外网络似乎覆盖肺泡壁结构，而产生细胞相关PNAG的Kp则主要出现在肺泡间隙中。

csgD-pgaA基因间区是Kp CC258谱系的突变热点

研究人员对9214个CC258基因组的pgaABCD操纵子及上下游区域进行了突变频率分析。结果表明，pgaABCD基因内部98.48%的碱基是保守的。相比之下，pgaA起始密码子与其上游最近基因（luxR家族转录调控因子csgD）之间的基因间区（IR）经历了频繁突变。特别地，在csgD上游36个碱基的位置（相对于ST11 HS11286参考基因组的403454位点）发生了19次碱基变化，其中17次为G>A替换，另有1次A>G回复突变和1次G>T替换。该G>A替换的频率位居ST11染色体突变频率最高的前0.03%。携带G>A替换或csgD缺失的菌株在系统发育树上均位于末端分支或近末端分支，未能发生克隆扩张，提示存在中等或长期的适应性代价。

反复出现的G>A突变导致PNAG超量产生

研究人员在ICC8001背景下构建了csgD缺失突变体（ΔcsgD）以及将403454位点G替换为A（-36_G>A）或T（-36_G>T）的点突变株。IF染色和定量分析显示，ΔcsgD完全消除了PNAG产生，表型与ΔpgaBCD一致；而-36_G>A/T突变株则在所有孔位均产生广泛分布的PNAG，且水平显著高于Kp_WT。值得注意的是，-36_G>A/T突变株还表现出密集的细菌聚集现象和细胞相关的PNAG表型（单个细菌周围呈环状染色），这种表型在PNAG超量产生株和无荚膜的ΔwcaJ突变体中均可观察到。

pgaR（csgD）是pgaABCD基因的转录调控因子

qRT-PCR结果显示，-36_G>A突变株中csgD转录水平显著高于Kp_WT，而-36_G>T虽有所升高但未达统计学显著性。相应地，-36_G>A突变株中pgaC的转录水平也显著升高。鉴于csgD紧邻pgaABCD上游的遗传共线性，以及在Kp中缺乏curli生物合成基因（而大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中CsgD是curli菌毛的正调控因子），且Kp CsgD与肠杆菌科CsgD同源物的氨基酸序列一致性仅为20%-22%，研究人员将Kp中的csgD正式命名为pgaR，以反映其作为PNAG生物合成上游调控因子的功能角色。pgaR存在于所有其他Kp复合体物种中，但在产酸克雷伯菌（K. oxytoca）基因组中缺失。

-36_G>A诱导的PNAG超量产生在体内减弱Kp毒力

研究人员通过气管插管感染CD-1小鼠评估了PNAG缺失（ΔpgaBCD）和PNAG超量产生（-36_G>A）对毒力的影响。在肺部感染模型中，Kp_WT和ΔpgaBCD感染的小鼠体重减轻程度相似（均值分别为10.45%和9.364%），而-36_G>A感染的小鼠体重减轻最小（均值4.73%）。肺细菌载量方面，Kp_WT和ΔpgaBCD之间无差异，但-36_G>A感染的肺CFU显著低于Kp_WT。此外，Kp_WT和ΔpgaBCD感染持续导致菌血症，而-36_G>A组仅有一只小鼠出现菌血症，血CFU显著降低。在腹腔感染模型中，Kp_WT和ΔpgaBCD感染的小鼠体重显著下降，而-36_G>A感染的小鼠维持了起始体重。然而，三种菌株均能引起原发性腹膜炎并播散至血液，且各菌株在腹腔和血液中的细菌载量无差异。这表明PNAG在该模型中对毒力非必需，但PNAG超量产生缓解了疾病表型。

讨论与结论

本研究的主要发现包括：首次确定胞外网络形成是Kp_WT在体外生长时PNAG的主要存在形式，这与PNAG在其他细菌中被描述为主要为细胞相关多糖的特征不同，提示PNAG在Kp中主要作为胞外基质成分而非单纯的表面相关多糖发挥作用。

关键突破在于鉴定出PgaR是PNAG生物合成的正调控因子。在革兰氏阴性菌中，pgaABCD操纵子的表达受多种全局调控通路控制（如大肠杆菌中的CsrA和NhaR），但这些调控因子均不在操纵子附近编码。本研究发现了一个紧邻pgaA上游编码的调控因子，揭示了大肠杆菌中未曾描述的基因座相关调控架构。这种基因组组织类似于革兰氏阳性菌中icaADBC基因座的排列方式，但与金黄色葡萄球菌中IcaR作为阻遏蛋白不同，PgaR发挥转录激活作用。

序列分析表明PgaR是FixJ/LuxR家族转录因子CsgD的一个趋异成员。鉴于Kp缺乏curli结构基因，且Kp与肠杆菌CsgD同源物之间存在显著序列差异，提示这个祖先调控蛋白已经发生了功能重新分配。研究人员使用PgaR这一命名以强调其在调控PNAG生物合成中的实验验证作用。

遗传和转录分析支持PgaR作为PNAG产生的上游激活因子：pgaR缺失废除PNAG产生，而pgaR表达升高与pgaABCD转录增强相关。但该研究尚不能区分调控是通过直接结合pgaABCD启动子还是通过中间调控网络实现，未来需要生化与基因组学研究来阐明分子机制。

比较基因组学分析显示该调控系统经历了谱系特异性进化。在CC258谱系中，研究人员鉴定出多个独立的pgaR功能缺失突变，以及pgaR上游反复出现的启动子突变（产生PNAG超量产生表型）。这两种相反的进化轨迹表明，在不同选择压力下，PNAG产生增加或减少都可能是有利的。然而，这两种基因型均未发生显著的克隆扩张，提示改变PNAG产生所带来的适应性益处是情境依赖性的，而非普遍适应性的。

PNAG超量产生的生物学后果为此提供了部分解释。-36_G>A启动子突变增加了PNAG产生但减弱了严重肺部感染期间的毒力。过量的PNAG产生可能带来代谢成本或改变其他毒力决定因子的表达或功能。PNAG超量产生株的有限传播与其持续过量产生胞外多糖所伴随的显著适应性代价一致。

研究数据进一步证明PNAG对毒力的贡献高度依赖于感染环境。虽然在hvKp株ICC8001的急性肺部感染中PNAG是非必需的，但既往研究表明PNAG在胃肠道定植和腹膜炎中贡献于毒力。感染生态位、细菌遗传背景以及额外毒力因子的存在等因素均可能影响PNAG在感染中的相对重要性。

此外，研究人员观察到PNAG在体外和体内条件下的定位差异。静态体外生长产生广泛的胞外PNAG网络，而肺部感染则以细胞相关PNAG为特征。在PNAG超量产生的启动子突变株和无荚膜的ΔwcaJ株中也观察到类似的体外表型，提示PNAG表达改变、荚膜丰度或两者共同影响聚合物定位。宿主衍生因子也可能在感染过程中参与基质组织。

研究结论：本研究鉴定了一个此前未被认识的调控Kp中PNAG生物合成的机制，证明PgaR是pgaABCD操纵子的基因座相关激活因子。研究结果揭示了PNAG在体外生长时主要形成胞外网络，PgaR活性的调节对PNAG产生具有深远影响，并且PNAG的丧失和超量产生均在CC258进化过程中反复出现。这些发现共同确立了PNAG调控作为一个动态进化靶点的地位，并为理解生物膜相关多糖产生如何促进Kp的适应和致病提供了框架。