《Horticulturae》：Comparative Assessment of Virus Elimination via Direct and Indirect Shoot-Tip Organogenesis in Purple Passion Fruit (Passiflora edulis Sims)
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三种病毒，即夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）、东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus, EAPV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV），被发现
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三种病毒，即夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）、东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus, EAPV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV），被发现广泛分布于中国紫色百香果（Passiflora edulis Sims）种植区，且在桂林采集的表现症状的田间样品中确认了这三种病毒的复合侵染。为评估单一茎尖培养对病毒脱除的效果，研究人员对离体器官发生进行了研究，并观察到直接（DOR）和间接（IOR）两种器官发生途径。在DOR途径中，器官发生芽和结节以40.83%的诱导率被诱导，14.86%的外植体产生了长度超过1 cm的不定芽。在IOR途径中，愈伤组织的诱导率为26.67%，从愈伤组织来源的分生组织样细胞团获得的芽诱导率为7.46%。半定量逆转录聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, semi-qPCR）分析显示，仅在少数再生植株中检测不到病毒RNA，且没有任何植株同时对两种或三种病毒检测为阴性。DOR和IOR途径之间可检测到病毒丢失的植株比例相当（TeMV：5.56% vs. 11.11%；EAPV：16.67% vs. 5.56%；CMV：27.78% vs. 16.67%）。所有检测的简单序列重复（Simple Sequence Repeat, SSR）位点在DOR途径中均为单态，而在IOR途径中观察到的多态性率为27.27%。这些发现表明，DOR途径在所评估的SSR位点上仅产生单态条带，同时能够产生少量病毒RNA水平低于semi-qPCR检测限的植株，为后续应用更灵敏的检测方法和联合处理策略提供了基础。
论文解读
一、研究背景与科学问题
百香果（Passiflora edulis Sims）是一种广泛栽培于热带和亚热带地区的多年生常绿藤本植物，其果肉因浓郁的香气和高营养价值而深受欢迎，不仅可供鲜食，还广泛用于果汁、冰淇淋、蛋糕和果酒等加工产品。百香果生长周期短，种植后4–6个月即可达到采收成熟度，具有投产早、经济效益高的特点。中国百香果栽培面积广阔，截至2019年约达3万公顷，主要产区分布在广西、广东、云南、海南、福建和贵州等地。随着种植面积不断扩大，对优质种苗的需求显著增加。百香果可通过种子繁殖，但有性繁殖导致果实成分和性状出现较大变异；也可通过扦插和嫁接等营养繁殖方式保持抗病性和高产等优良性状，然而长期营养繁殖可能促进病毒积累，导致品种退化、抗病性下降和产量降低。
前期调查显示，在中国贵州主产区采集的308份叶片样品中至少鉴定出7种侵染百香果的病毒，包括夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）、东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus, EAPV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、 Euphorbia leaf curl virus（ELCV）、西番莲潜伏病毒（Passiflora latent virus, PLV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）和西番莲Y病毒（Passiflora virus Y, PaVY），感染率分别为50%、19%、15%、6%、1%、0.6%和0.3%，且该省还鉴定出TeMV、CMV和EAPV三种病毒8%的高复合侵染率。通过脱除病毒，可以有效恢复经济作物的产量和品质。目前，离体茎尖培养单独或与热疗、冷冻或化学疗法联合使用是消除植物病毒的常用方法，已应用于草莓、猕猴桃、马铃薯和葡萄等多种植物。然而，关于百香果病毒消除的研究较少，且茎尖培养在百香果中从叶原基再生的效率较低，受植物生长调节剂比例、外植体大小和物种等因素影响，病毒消除效率与再生能力密切相关。百香果不同器官发生途径对茎尖脱毒效率的影响尚不清楚，这正是本研究要解决的核心问题。
二、研究内容与主要结论
本研究以广西桂林地区表现典型病毒症状（叶片卷曲和皱缩）的紫色百香果品系‘Guizao’（GZ）为材料，该品系源自云南瑞丽海拔1800 m高海拔地区的野生植株，经人工选育为矮化品系并引入广西植物研究所温室，通过扦插进行营养繁殖。研究人员首先检测并鉴定了广西紫色百香果中同时侵染的三种病毒，然后对百香果茎尖外植体的离体器官发生进行了特征描述，并在显微水平上检查了各再生途径中的细胞，随后通过半定量逆转录聚合酶链反应（semi-qPCR）分析比较了两种途径再生株系中可检测到病毒丢失的植株比例，最后利用简单序列重复（SSR）分子标记分析评估了母株与再生株系之间的多态性条带百分比。
研究得出以下主要结论：第一，从表现症状的百香果植株中鉴定出TeMV、EAPV和CMV三种病毒，序列分析确认了其病毒身份，系统发育分析揭示了广西分离物与特定参考分离物的亲缘关系。第二，茎尖外植体在从高浓度6-BA（4.43 μM）转移到低浓度6-BA（0.44 μM）的培养基上40 d后，同时诱导出直接（DOR）和间接（IOR）器官发生两种途径，DOR途径的器官发生芽和结节诱导率为40.83%，显著高于IOR途径的愈伤组织诱导率26.67%；培养120 d后，DOR途径的不定芽（>1.0 cm）诱导率为14.86%，显著高于IOR途径的7.46%。第三，显微结构分析揭示了两种途径的细胞学起源：DOR途径中分生组织样细胞团和器官发生结节起源于中柱鞘区域，而IOR途径中它们位于愈伤组织外周；DOR过程中器官发生芽和结节可能与偶发愈伤组织共存于同一外植体上。第四，semi-qPCR分析显示，两种途径再生植株中三种病毒的RNA水平均低于母株，但可检测到病毒丢失的植株比例在两种途径之间无显著差异（TeMV：5.56% vs. 11.11%；EAPV：16.67% vs. 5.56%；CMV：27.78% vs. 16.67%），且没有任何植株同时对两种或三种病毒检测为阴性。第五，SSR分析显示DOR途径在所检测位点均为单态，而IOR途径的多态性率为27.27%，表明DOR途径能更好地保持遗传稳定性。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要技术方法包括：RT-PCR病毒检测与序列克隆鉴定，基于NCBI数据库序列的系统发育分析；茎尖外植体（1.0–1.5 mm）离体培养与器官发生诱导，通过逐步降低6-BA浓度实现DOR和IOR两种途径的诱导与不定芽再生；石蜡切片、体视显微镜和扫描电子显微镜（SEM）进行显微结构观察；以PeEF1α为内参基因的半定量RT-PCR（semi-qPCR）检测三种病毒RNA相对水平；SSR分子标记分析评估母株与再生株系间的遗传多态性。样本来源为广西植物研究所温室中经RT-PCR确认同时感染TeMV、EAPV和CMV的四株独立母株。
四、研究结果
3.1 部分核苷酸序列的扩增。 使用特异性引物扩增获得TeMV（918 bp）、EAPV（883 bp）和CMV（619 bp）的部分核苷酸序列，BLAST分析分别与江西分离物‘RJ’（99.46%一致性）、越南分离物‘GL1’（99.77%一致性）和河南分离物‘yang-ss3-2’（97.74%一致性）高度同源，确认了三种病毒的感染。
3.2 TeMV、EAPV和CMV的系统发育分析。 系统发育树显示TeMV-GX-GL1与中国武夷山分离物聚为一支；EAPV分为AO和IB两个谱系，AO谱系呈现明显的地域聚类，广西分离物与越南分离物聚在一起；CMV分为IB、IA和II三个亚组，广西分离物与湖北分离物亲缘关系密切。
3.3 茎尖外植体的形态发生反应。 外植体在含1 mg·L?1 6-BA的培养基上培养30 d后形成早期叶原基，转移到含0.1 mg·L?1 6-BA的OR培养基上40 d后，DOR途径的器官发生芽和结节诱导率为40.83%，IOR途径的愈伤组织诱导率为26.67%；培养120 d后，DOR途径的不定芽诱导率（14.86%）显著高于IOR途径（7.46%）。约30%的外植体因逐渐褐化而未能再生。
3.4 直接和间接器官发生的起源。 显微结构分析将细胞团分为三种类型：I型（DOR，80 d）表现为绿色致密团块，中柱鞘区域有分生组织样细胞团和器官发生结节；II型（IOR，80 d）由淡绿色和淡黄色区域交织组成，分生组织样细胞团覆盖绿色区域；III型（DOR和IOR共存，100 d）兼具两种特征，可见不定芽和维管柱。DOR途径的叶原基可追溯到中柱鞘区域的分生组织样细胞团和器官发生结节，而IOR途径则源于愈伤组织外周的分生组织样细胞团。
3.5 通过semi-qPCR分析TeMV、EAPV和CMV病毒水平。 以PeEF1α为内参进行归一化后，两种途径再生植株中三种病毒的条带强度均弱于母株。DOR和IOR途径中检测不到病毒条带的植株比例分别为：TeMV 5.56%和11.11%，EAPV 16.67%和5.56%，CMV 27.78%和16.67%，Fisher精确检验显示两种途径之间无显著差异，且没有植株同时对两种或三种病毒检测为阴性。
3.6 检测SSR位点的多态性条带百分比。 从6对SSR引物中筛选出3对在母株和再生株系中均产生清晰条带的引物。DOR途径共记录10条扩增条带，未检测到多态性条带；IOR途径共记录11条扩增条带，其中3条为多态性条带，多态性率为27.27%。
五、讨论与结论
讨论部分指出，器官发生结节（也称为“有组织愈伤组织”）是未分化与分化组织之间的过渡状态，其形成通常避免大量无序愈伤组织增殖，能在适宜条件下直接再生芽、根和叶状结构。本研究中茎尖器官发生受培养时间和6-BA浓度共同影响，低浓度植物生长调节剂能促进大多数植物物种从器官发生结节更有效地再生，这与前人研究一致。组织学分析澄清了两个问题：DOR过程中器官发生结节周围偶发愈伤组织形成，以及IOR中再生的簇生叶原基来源不确定。DOR和IOR途径并非相互排斥，同一外植体上可能同时激活两种途径，因此早期切除偶发愈伤组织对维持相对一致的器官发生途径至关重要。器官发生结节即使在长期增殖后仍能保持稳定的遗传特性和较强的分化能力，而愈伤组织外周细胞常发生无丝分裂和核碎裂，通过愈伤组织中间阶段再生往往导致植株遗传不稳定，这与本研究中IOR途径27.27%的SSR多态性率一致。半定量RT-PCR灵敏度有限，未检测到条带并不能精确证明病毒-free状态，且所有病毒靶标循环数设为33，低丰度样品可能出现假阴性结果，未来应采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）进行更精确的病毒RNA拷贝数定量。由于病毒在植物组织内分布不均匀，茎尖是病毒脱除的首选外植体，但本研究中使用的茎尖较大（1.0–1.5 mm），可能导致残留病毒。结论部分总结道：为消除桂林表现症状的百香果植株中鉴定出的三种病毒（TeMV、EAPV和CMV），通过DOR和IOR两种器官发生途径进行了茎尖培养。两种途径在从高浓度转移到低浓度6-BA后40 d均被诱导，但约30%的外植体褐化未能再生。DOR途径的不定芽诱导率高于IOR途径，且DOR途径未检测到SSR多态性条带，而IOR途径多态性率为27.27%。大多数来源于较大茎尖外植体的再生植株仍携带可检测水平的病毒，表明仅通过茎尖培养难以实现完全脱毒。在本实验条件下，两种途径之间可检测到病毒丢失的植株比例相当，且没有植株同时对两种或三种病毒检测为阴性。DOR和IOR途径之间病毒脱除无显著差异，加之semi-qPCR灵敏度有限，表明需要更灵敏的检测方法和联合处理策略来实现多种病毒的完全消除。
