《Current Issues in Molecular Biology》：Comparative Analysis of Three Preparation Strategies for AntiMicrobial Peptides and Their Antibacterial Efficacy
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抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）因其广谱杀菌活性和较低的诱导细菌耐药性风险，被视为后抗生素时代最具潜力的候选药物之一。然而，由于抗菌肽分子量较小，且对表达宿主具有固有细胞毒性，未修饰的抗菌肽在原核系统中直接表达时往往表现为可溶
抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）因其广谱杀菌活性和较低的诱导细菌耐药性风险，被视为后抗生素时代最具潜力的候选药物之一。然而，由于抗菌肽分子量较小，且对表达宿主具有固有细胞毒性，未修饰的抗菌肽在原核系统中直接表达时往往表现为可溶性表达差、产量低。本研究采用引物互补PCR组装了三种抗菌肽（Swine_2、P3-3R-8I和QLX-3DV-1）的编码序列，并通过酶切连接构建了覆盖三种融合标签系统的九个重组表达载体，即pET32a-Swine_2、pET32a-P3-3R-8I、pET32a-QLX-3DV-1、pET32a-GSHHW-Swine_2、pET32a-GSHHW-P3-3R-8I、pET32a-GSHHW-QLX-3DV-1、pET3C-SUMO-Swine_2、pET3C-SUMO-P3-3R-8I和pET3C-SUMO-QLX-3DV-1。所得质粒转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)后，在IPTG诱导和自诱导条件下分别表达九种融合蛋白。融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后，分别通过肠激酶（enterokinase）酶切、SNAC（sequence-specific nickel-assisted cleavage，序列特异性镍辅助切割）化学切割或SUMO蛋白酶酶切释放目标抗菌肽，并采用超滤法回收多肽。利用琼脂扩散试验和肉汤微量稀释法系统比较了回收肽对E. coli和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌活性。结果表明，三种策略均能获得具有生物活性的抗菌肽。对于同一肽骨架，三种制备方法得到的MIC值一致，而经SUMO蛋白酶释放的抗菌肽产生了最大的抑菌圈。由于同一骨架的三种制备产物具有相同的氨基酸一级序列和相同的MIC值，该差异不能归因于肽本身内在效力的差异，本研究将其视为半定量观察结果。该研究为抗菌肽的工程化生产提供了完整的技术流程和方法学参考。
抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）是几乎存在于所有生物体中的天然小分子先天免疫效应分子，具有广谱杀菌能力、低耐药风险和免疫调节功能。全球抗菌素耐药性危机使多重耐药菌感染的临床处理变得极为复杂，抗菌肽因而被定位为传统抗生素最有前景的替代方案之一。与传统抗生素相比，抗菌肽具有三方面机制优势：第一，多数传统抗生素作用于单一分子靶点，单点突变或获得性耐药基因即可使其失效，而抗菌肽主要作用于细菌胞质膜，这一靶标难以被细菌在不丧失活力的前提下大规模重构，因此耐药性发展极为缓慢；第二，抗菌肽通过物理性膜破裂快速杀菌，且对非生长态或休眠态细胞和生物被膜仍具活性；第三，抗菌肽常具有中和脂多糖和脂磷壁酸、调节宿主免疫应答、协同增强传统抗生素活性等额外功能。然而，天然组织提取产量极低和固相化学合成成本高昂两大瓶颈仍制约着抗菌肽的大规模工业应用，基因工程微生物表达因此成为低成本、规模化生产抗菌肽的核心策略。抗菌肽的抗菌活性由相互关联的结构与理化参数决定，其中净电荷、疏水性、两亲性和构象柔性最为重要。大肠杆菌是应用最广泛的原核表达宿主，但阳离子抗菌肽面临两个关键障碍：一是抗菌肽分子量仅2–5 kDa，易被宿主内源蛋白酶降解；二是带正电荷的抗菌肽可穿入大肠杆菌胞质膜，导致宿主细胞死亡，阻碍游离抗菌肽的高效生产。与融合标签共表达可同时改善肽的溶解度并减轻宿主细胞毒性，因为标签掩蔽了抗菌肽的阳离子特性并将其以可溶性、非活性形式隔离，直至标签被切除。目前常用的标签切除系统分为蛋白酶酶切和序列特异性化学切割两大类，肠激酶、SUMO蛋白酶和SNAC化学切割分别代表三种技术上均可行的方案，三者恰好在决定工艺经济性的关键性质上存在差异。此前尚无研究针对同一组抗菌肽支架对上述三种策略进行系统平行比较，因此选择通常是经验性的。本研究选取三种代表性新型抗菌肽，构建携带肠激酶、SNAC或SUMO切割位点的九个重组载体，在IPTG诱导和自诱导两种条件下表达融合蛋白，经Ni-NTA层析纯化和三种不同的切割流程处理后，系统比较了多肽回收率、抑菌圈直径、MIC值和细菌活力曲线，为针对不同生产规模和活性需求的抗菌肽制备工艺选择提供了全面的实验证据。
研究人员首先通过引物互补PCR成功扩增了三种抗菌肽（Swine_2、P3-3R-8I和QLX-3DV-1）的编码序列以及GSHHW标记和SUMO串联片段，共九个DNA片段。将目标片段插入pET32a和pET3C骨架后，经菌落PCR和Sanger测序验证，九个重组质粒的插入片段均与设计序列100%一致。随后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，比较IPTG诱导与ZYM-5052自诱导两种表达策略，SDS-PAGE结果显示自诱导获得的融合蛋白产量显著高于短时IPTG诱导，因此后续纯化使用自诱导24 h收获的细胞。研究人员采用Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白，并将九个融合蛋白统一调整至0.1 mg/mL，分别经肠激酶酶切（25 °C，16 h）、SNAC化学切割（室温，10 h）和SUMO蛋白酶酶切（37 °C，10 h）释放目标抗菌肽，再经10 kDa超滤分离回收。融合蛋白（≥14 kDa）用BCA法定量，而回收的2–6 kDa抗菌肽因BCA法不适用，改用反相高效液相色谱（RP-HPLC）以对应合成肽为标准品定量，并以280 nm吸光度进行交叉验证。抗菌活性评估采用琼脂扩散试验、肉汤微量稀释法和细菌活力测定三种方法，其中MIC测定遵循CLSI M07标准，活力曲线采用四参数逻辑模型拟合计算IC
50。
研究结果部分的主要发现包括以下几个方面。关于三种候选抗菌肽的理化特征，Swine_2、P3-3R-8I和QLX-3DV-1长度从14到46个氨基酸不等，均为阳离子肽，在生理pH下带正电荷，符合靶向细菌胞质膜的核心结构要求；GSHHW标签的N端融合一致地增加了净电荷并略微增强了疏水性。PCR扩增方面，引物互补PCR成功合成九个目标DNA片段，3%琼脂糖凝胶电泳显示特异性条带，其中GSHHW标记片段与天然片段仅差15 bp，无法在凝胶中分辨，其准确性通过Sanger测序确认。重组载体经菌落PCR和测序验证，所有插入片段与设计完全一致。表达比较方面，自诱导系统获得的融合蛋白产量显著高于IPTG诱导，因此选择自诱导24 h细胞用于纯化。可溶性表达与Ni-NTA纯化方面，超声破碎后多数融合蛋白存在于可溶性上清中，Ni-NTA重力柱层析成功获得高纯度融合蛋白。三种切割策略方面，肠激酶、SNAC和SUMO蛋白酶均能高效释放目标抗菌肽，Tricine SDS-PAGE显示条带与理论分子量一致，超滤获得高纯度单组分抗菌肽制剂；以理论最大产量为基准归一化计算回收率后，SUMO蛋白酶酶切的回收率最高，其次是SNAC化学切割，肠激酶酶切最低。抗菌活性方面，琼脂扩散试验显示九个抗菌肽变体对E. coli ATCC 8739和S. aureus ATCC 25923均有可测定的抑制活性，其中QLX-3DV-1的整体抗菌效力最强；SUMO蛋白酶释放的抗菌肽抑菌圈显著大于SNAC修饰肽和肠激酶酶切肽，但肉汤微量稀释法测定的同一骨架三种制备产物的MIC值完全一致，表明抑菌圈差异反映的是活性肽递送量的不同而非内在效力的差异。细菌活力曲线显示九个制备产物均呈浓度依赖性降低相对活力，且效力排序与MIC结果一致，证实三种切割策略可获得内在活性相当的抗菌肽。
讨论部分指出，引物互补PCR无需天然基因组模板，操作简单并缩短了载体构建周期，特别适合50个氨基酸残基以内的抗菌肽。自诱导培养基利用碳源代谢调控自动激活T7启动子驱动的表达，细胞密度和融合蛋白总产量均高于短时IPTG诱导，更适合实验室批量纯化和工业放大。肠激酶是传统的标签切除金标准试剂，特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys五肽基序，可在温和条件下释放具有天然N端的靶肽，但商品化肠激酶价格高昂且16 h的长时间孵育增加了非特异性降解风险。SNAC无酶化学切割依赖低成本缓冲盐和镍离子介导序列特异性肽键水解，在量产中具有明显经济优势，但会在抗菌肽N端留下SHHW四肽残基，改变电荷与疏水平衡，可能削弱抗菌活性。SUMO蛋白酶识别SUMO的完整三维构象而非线性氨基酸基序，切割后不留任何残基，可完整保留抗菌肽的天然一级结构和构象特征，最大程度维持内在杀菌活性，但商品化SUMO蛋白酶成本较高，适用于小批量高活性要求的制备。三种制备策略的共同局限是加工过程中有相当一部分靶肽丢失，主要机制包括超滤膜截留分布导致的共保留、阳离子肽对膜和管壁的非特异性吸附、切割缓冲液促进的肽聚集以及融合蛋白切割不完全。融合切割系统的工业选择本质上是一个经济优化问题，应以单位活性肽成本为衡量标准。综合来看，三种切割系统均能可靠地产生有生物活性的Swine_2、P3-3R-8I和QLX-3DV-1变体，定量明确了SUMO蛋白酶酶切、SNAC化学切割和肠激酶酶切在回收率、残留抗菌活性和生产成本之间的梯度差异。同一骨架的三种制备产物MIC值相同，琼脂扩散试验中的差异反映的是活性肽递送量而非内在效力区别。该标准化实验流程和方法学比较为基于蛋白质语言模型挖掘、理性突变和深度学习从头设计的抗菌肽的大规模工程化生产提供了重要参考。结论部分确认，三种制备策略均获得了具有完整抗菌活性的抗菌肽；SUMO蛋白酶酶切能完整保留天然肽序列并在本次数据中产生最大抑菌圈，SNAC化学切割为工业放大提供了最具成本效益和操作简单的工作流程，肠激酶酶切仍是常规实验室制备生物活性肽最成熟和广泛采用的标准方法；同一肽骨架的三种制备产物具有相同的MIC值，表明切割策略的选择影响所得活性肽的数量而非其内在效力；根据重新定量的数据，SUMO蛋白酶酶切的肽回收率最高，其次是SNAC化学切割和肠激酶酶切。
