《Current Issues in Molecular Biology》：Emapalumab in IFN-γ-Driven Hyperinflammatory Disorders: Mechanisms, Clinical Evidence, and Emerging Therapeutic Applications
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转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，包括抑制素（inhibins）和激活素（activins），是在结构上相关的信号蛋白，调控生殖与内分泌生理过程。尽管这些蛋白共享保守的半胱氨酸结（cystine-knot）架构，但亚基组成与分子组织方式的差异导致了不同
转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，包括抑制素（inhibins）和激活素（activins），是在结构上相关的信号蛋白，调控生殖与内分泌生理过程。尽管这些蛋白共享保守的半胱氨酸结（cystine-knot）架构，但亚基组成与分子组织方式的差异导致了不同的生物学活性，并使其分析鉴别变得复杂。本研究采用拉曼光谱（Raman spectroscopy），在532 nm激发、完全一致的实验条件下，对重组人抑制素α亚基（INHA）、重组人抑制素βB亚基（INHBB（βB-subunit））以及激活素A（βA-βA同源二聚体）进行了表征。拉曼光谱经基线校正、Savitzky–Golay平滑及面积归一化处理后，在500–1800 cm?1蛋白指纹区内观察到明显的谱峰特征差异，尤其体现在S–S伸缩振动区、芳香族氨基酸残基区、酰胺III区及酰胺I区。其中，INHA在S–S伸缩振动区显示出最高的相对贡献强度，而苯丙氨酸及酰胺相关谱带的差异进一步区分了三种蛋白。上述结果表明，在所研究的固态条件下，拉曼光谱可能包含足以区分结构高度相似的抑制素/激活素蛋白的分子信息。因此，拉曼光谱为TGF-β超家族蛋白的分子指纹鉴定提供了一种无需标记（label-free）的互补手段，并可能有助于其分子表征。
一、研究背景与问题提出
转化生长因子-β（TGF-β）超家族包含30余种结构相关的信号蛋白，广泛参与胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡、组织重塑及内分泌稳态等生物学过程。其中，抑制素（inhibins）与激活素（activins）是生殖生理的重要调控因子，主要通过影响垂体前叶卵泡刺激素（FSH）的分泌发挥作用。抑制素为由α亚基与βA或βB亚基组成的异源二聚体糖蛋白，分别构成抑制素A（α-βA）与抑制素B（α-βB）；激活素则为β亚基的同源或异源二聚体，包括激活素A（βA-βA）、激活素B（βB-βB）及激活素AB（βA-βB），通常促进FSH的合成与分泌。两类配体共同参与下丘脑-垂体-性腺轴及卵泡发育的调控。此外，抑制素与激活素信号的失调还与炎症、纤维化、组织重塑及多种组织中的肿瘤进展相关。
从结构上看，抑制素与激活素共享TGF-β超家族特征性的半胱氨酸结（cystine-knot）基序，即由二硫键稳定的核心结构及延伸的β-折叠区域，这一结构赋予配体稳定性并参与受体识别。抑制素α亚基的存在形成了区别于激活素的结构特征，并使其能够与辅助受体betaglycan相互作用，从而拮抗激活素信号。尽管整体折叠保守，但亚基组成、二硫键组织方式、二聚体界面几何结构及构象灵活性的差异决定了各自的生物学活性。
然而，TGF-β家族蛋白的高度结构相似性给分析鉴别带来了挑战。相关β亚基在序列和结构上高度相似，并采用相近的半胱氨酸结折叠方式。常规免疫分析（如ELISA和Western blotting）虽能提供蛋白丰度信息，但依赖抗体特异性，对蛋白内在分子结构的解析能力有限；质谱分析虽可实现详细的分子表征，但通常需要样品前处理，且难以反映原始测量条件下的构象状态。拉曼光谱（Raman spectroscopy）作为一种无需标记的互补手段，通过探测与蛋白组成和结构相关的内源分子振动提供信息，其对二硫键、芳香族氨基酸残基及肽骨架酰胺I–III区振动的敏感性，使其有望捕捉相关蛋白间的细微分子差异。
尽管cystine-knot支架在TGF-β超家族中高度保守，但各配体在二硫键拓扑、受体结合界面及构象动力学方面存在差异，这些分子差异可能产生可区分的振动特征。然而，迄今针对抑制素α亚基（INHA）、抑制素βB亚基（INHBB（βB-subunit））与激活素A（βA-βA同源二聚体）的拉曼光谱比较表征研究十分有限。为此，研究人员开展了本项研究，旨在评估上述三种蛋白的拉曼光谱特征是否能够实现可靠区分，为其无需标记的鉴定与表征提供基础。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员在完全一致的实验条件下，利用532 nm激发的共聚焦拉曼显微镜，对重组人INHA、INHBB（βB-subunit）及激活素A（βA-βA同源二聚体）进行了拉曼光谱采集。三种蛋白均以商业供应形式直接测量，其中INHA与激活素A为冻干粉直接沉积分析，INHBB（βB-subunit）以厂家储存缓冲液形式原样分析。每种蛋白从5个独立制备样品中采集光谱，每个样品在3个不同空间位置测量后取平均，最终对5个独立制备的平均光谱再次取平均。光谱采集范围为300–2800 cm?1，积分时间15秒、累加2次。数据处理采用OriginPro 2025b完成，包括三阶多项式基线校正、Savitzky–Golay平滑（五阶多项式、50点窗口）及300–2800 cm?1全谱面积归一化。此外，研究人员还生成了选定特征拉曼谱带（包括S–S伸缩、苯丙氨酸、酪氨酸及酰胺III区）归一化强度的热图，以直观比较三种蛋白的谱带强度差异。
三、研究结果
3.1 TGF-β超家族蛋白的拉曼光谱谱型分析
在相同仪器与采集条件下，研究人员获取了重组人INHA、INHBB（βB-subunit）与激活素A的拉曼光谱。三种蛋白在蛋白指纹区（500–1800 cm?1）均呈现特征性拉曼谱带，涵盖二硫键、芳香族氨基酸残基及肽骨架振动等特征。主要考察的谱区包括S–S伸缩区（500–550 cm?1）、酪氨酸相关谱带（约830–850 cm?1）、苯丙氨酸环呼吸模式（约1000–1030 cm?1）、酰胺III区（1220–1300 cm?1）及酰胺I区（1600–1700 cm?1）。尽管三种蛋白共享TGF-β超家族保守的cystine-knot框架，但其拉曼谱型在相对谱带强度和谱峰分布上存在差异，表明三种蛋白的拉曼指纹包含与分子组成和结构组织差异相关的可区分特征。
3.2 特征拉曼谱带比较
研究人员对三种蛋白的结构相关拉曼谱带进行了比较。在二硫键伸缩区（500–550 cm?1），INHA表现出最高的相对强度。芳香族氨基酸残基区也观察到差异，包括酪氨酸双峰（约830–850 cm?1）及苯丙氨酸环呼吸谱带（约1002–1016 cm?1），这些差异可能与芳香族残基局部环境的差异有关。酰胺III区（1220–1300 cm?1）与酰胺I区（1600–1700 cm?1）同样呈现谱型变化，这些区域主要反映肽骨架振动。虽然上述特征区在三种蛋白中均存在，但相对强度和谱型分布各有不同，共同构成了各自的分子指纹。归一化特征谱带相对强度的热图直观展示了这些差异。
四、讨论与结论
讨论部分总结： 研究表明，重组人INHA、INHBB（βB-subunit）与激活素A在所研究的实验条件下呈现可区分的拉曼光谱特征，实现了基于分子振动特征的无需标记鉴别。最显著的谱带差异出现在二硫键伸缩区（500–550 cm?1），这与TGF-β家族蛋白富含半胱氨酸的特征一致。拉曼光谱对S–S伸缩振动的频率和强度敏感，其变化取决于二硫键构象、二面角及周围分子环境。酰胺I区及芳香族氨基酸残基区的差异可能与局部骨架环境、侧链环境、氢键及分子堆积的差异有关。研究人员同时指出，本研究为概念验证性质，存在若干局限性：首先，三种蛋白以不同物理状态（冻干粉与缓冲液）测量，样品状态差异可能影响光谱并限制直接结构比较；其次，研究仅纳入三种重组蛋白，未涵盖完整抑制素B（α–βB）、激活素B、激活素AB、受控蛋白混合物或复杂生物基质；未来研究应纳入独立制备的重复样品、水合条件下的测量、完整抑制素/激活素二聚体、更多TGF-β超家族成员及受控混合物，并可在低浓度或复杂生物样品中考虑表面增强拉曼光谱（SERS）以提高灵敏度。
结论部分翻译： 据研究人员所知，本研究首次对重组人INHA、INHBB（βB亚基）及激活素A进行了比较性拉曼表征。研究结果提示，拉曼光谱能够捕获结构高度相关的TGF-β超家族蛋白之间的分子差异，并可提供与传统浓度测定方法互补的分子及结构相关信息。然而，这些拉曼特征并不直接测量蛋白构象或各二级结构元件。因此，当前结果应被视为概念验证而非诊断性能的证据。未来需要利用独立制备的样品、受控水合条件、完整抑制素/激活素二聚体、生物学相关基质及充分重复的数据集开展进一步研究，以确定拉曼光谱在TGF-β超家族蛋白分子表征与研究中更广泛的适用性。
