《Aquaculture Reports》：Investigating the role of fructose-1,6-bisphosphate aldolase in the saline-alkaline tolerance of Gymnocypris przewalskii
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为探究果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA）在青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）耐盐碱过程中的作用，本实验设置5个处理组：CG（盐度0‰，碱度0 mmol/L）、S
为探究果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA）在青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）耐盐碱过程中的作用，本实验设置5个处理组：CG（盐度0‰，碱度0 mmol/L）、SA1（盐度4‰，碱度8 mmol/L）、SA2（盐度8‰，碱度16 mmol/L）、SA3（盐度12‰，碱度24 mmol/L）和SA4（盐度16‰，碱度32 mmol/L）。通过克隆青海湖裸鲤FBA基因（gpfba）、分析其组织表达特征，并检测葡萄糖代谢通路中的关键酶，对青海湖裸鲤的耐盐碱性进行了深入分析。结果表明，青海湖裸鲤的fba基因家族包含三个亚型：gpfba-a、gpfba-b和gpfba-c，其编码区长度分别为1095 bp、1095 bp和1092 bp，编码蛋白的相对分子质量介于39～40 kD之间，均属于稳定蛋白。gpfba三个亚型与金线鲃属（Sinocyclocheilus）和鲤（Cyprinus carpio）的亲缘关系较近，而与哺乳动物的亲缘关系较远。gpfba家族基因在鳃、肾、肠和肝等组织中广泛表达。在盐碱胁迫下，gpfba-c在鳃、肾、肝和肌肉中的表达上调。此外，鳃、肾、肝和肌肉中的FBA含量升高。在盐碱胁迫下，鳃、肾和肝中的葡萄糖、己糖激酶（hexokinase, HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）等葡萄糖代谢物质总体呈上升趋势。盐碱胁迫降低了肌肉葡萄糖和PEPCK含量以及PK活性。研究表明，在盐碱胁迫下，FBA参与并促进了鳃、肾和肝中的葡萄糖代谢，而肌肉中的葡萄糖代谢（糖酵解/糖异生）减弱，从而使青海湖裸鲤能够快速适应盐碱环境。
一、研究背景与科学问题
青海湖是青藏高原典型的盐碱湖，具有低温、低氧、高盐、高碱等极端环境特征。湖水离子组成以Cl?、Na?和Mg2?为主，盐度约15‰，可滴定碱度26～32 mmol/L（pH 9.0～9.5），这种环境对大多数硬骨鱼类而言难以生存。然而，青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）作为青海湖特有鱼类，不仅适应了极端盐碱条件，还在维持当地生态系统稳定性中发挥关键作用。已有研究表明，极端高原环境能够重塑生物体的基因表达谱，使鱼类获得适应性功能基因。因此，鉴定青海湖裸鲤耐盐碱相关基因对于理解其适应机制具有重要意义。
果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA）是生物能量代谢中的关键酶，广泛分布于动植物中，其主要功能是催化果糖-1,6-二磷酸可逆裂解为磷酸二羟丙酮（dihydroxyacetone phosphate, DHAP）和3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate, G3P），参与糖酵解、糖异生和磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）等多个碳水化合物代谢通路。在脊索动物中，FBA分为a、b、c三类，其中fba-a主要参与糖酵解，fba-b在肝等代谢活跃组织中参与糖异生和PPP，fba-c则与渗透压调节和耐盐碱能力相关。在鱼类中，多种经济鱼类的fba基因已被克隆，但FBA在青海湖裸鲤耐盐碱过程中的作用尚不清楚。
环境胁迫通常诱导生物体产生应激反应，这一过程需要消耗大量能量，因此生物体在不良环境条件下常表现出能量代谢变化。青海湖裸鲤生长缓慢，可能与其在盐碱条件下能量重新分配有关。研究人员假设FBA可能在这一能量重分配中发挥关键作用。已有研究表明，FBA通过糖酵解、糖异生和PPP等多条糖代谢通路介导其功能。例如，珍珠龙胆石斑鱼肝中fba-b在低氧条件下表达上调并促进糖酵解；红鳍东方鲀在能量缺乏时上调fba-a表达以增强糖酵解和PPP；卵形鲳鲹在急性低氧胁迫下fba-a和fba-cb表达显著上调，促进糖酵解并产生更多丙酮酸和ATP。这些发现提示FBA可能通过参与糖代谢通路增强青海湖裸鲤的耐盐碱性。
在鱼类糖代谢中，己糖激酶（hexokinase, HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）是糖酵解的重要限速酶；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK）在糖异生中催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，维持动物血糖稳定；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）催化PPP第一步反应，合成NADPH，与能量平衡、生长速率和细胞活力密切相关。通过检测这些关键代谢酶的表达水平，可以评估糖代谢通路的功能状态，进而阐明FBA与抗逆性的关系。
为阐明青海湖裸鲤耐盐碱性与糖代谢的关系，研究人员以FBA为研究对象，通过基因克隆和生物信息学分析获得青海湖裸鲤fba（gpfba）的基础信息，并通过盐碱胁迫实验证明FBA参与糖代谢通路，从而响应盐碱胁迫。该研究从能量角度阐明了青海湖裸鲤的耐盐碱过程，揭示了其生长缓慢的原因之一。
二、主要技术方法
研究人员从青海湖采集3～4龄、平均体长（23.33±3.89）cm、平均体重（128.13±7.83）g的青海湖裸鲤，在青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室的高原冷水鱼循环水设施中进行实验。设置淡水对照组（CG，盐度0‰、碱度0 mmol/L）和4个盐碱处理组（SA1～SA4，盐度4‰～16‰、碱度8～32 mmol/L），每组设3个重复（n=30）。以NaCl、Na?CO?和NaHCO?配制不同盐碱浓度，每天递增盐度0.8‰和碱度1.6 mmol/L，每5天达到下一采样梯度。采用TRIzol法提取总RNA并反转录为cDNA，基于转录组数据（CRA026038）设计引物，通过PCR克隆gpfba三个亚型全长编码区。使用NCBI ORFfinder预测开放阅读框，CLUSTAL X 2.1进行多重序列比对，MEGA 7.0以邻接法构建分子系统发育树，ProtParam预测蛋白质理化性质，SOPMA预测二级结构，TMHMM预测跨膜结构域。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测gpfba基因组织表达及盐碱胁迫下的表达变化（内参基因ef-1α）。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定葡萄糖、HK和PK活性，使用江苏苏美克生物科技有限公司ELISA试剂盒测定FBA、PEPCK和G6PD含量。
三、研究结果
3.1 基因克隆与生物信息学分析
基因克隆结果显示，青海湖裸鲤fba基因家族包含三个亚型：gpfba-a和gpfba-b编码区长度为1095 bp，编码364个氨基酸；gpfba-c编码区长度为1092 bp，编码363个氨基酸。三个亚型核苷酸序列一致性为81.43%，氨基酸序列一致性为82.51%。ProtParam预测FBA-A理论分子量39.64 kDa，等电点8.60；FBA-B理论分子量39.58 kDa，等电点8.86；FBA-C理论分子量39.30 kDa，等电点6.04；三者均属稳定蛋白。亚细胞定位预测显示gpfba-a和gpfba-c主要定位于细胞质，gpfba-b定位于线粒体和细胞质。SOPMA预测三种蛋白均以α-螺旋为主，TMHMM预测三种FBA蛋白均无跨膜序列。氨基酸序列比对显示，gpfba-a与抚仙金线鲃（Sinocyclocheilus grahami）一致性最高（96.89%），gpfba-b与安水金线鲃等一致性最高（95.88%），gpfba-c与鲤等一致性最高（96.14%）。系统发育树显示gpfba-a与S. grahami亲缘关系最近，gpfba-b与S. anshuiensis最近，gpfba-c与鲤形成独立分支，三者与哺乳动物亲缘关系较远。
3.2 gpfba组织表达及FBA酶浓度分析
淡水条件下，gpfba-a在肠中表达最高，其次为鳃、肾和脾，心脏和肌肉中最低；gpfba-b和gpfba-c均在鳃中表达最高，其次为肾和肠，gpfba-b在心脏中最低，gpfba-c在脑中最低。盐碱胁迫下，鳃中gpfba-a和gpfba-b均在SA2组表达最低，gpfba-a在SA3组最高，gpfba-b在SA1组最高；gpfba-c表达随盐碱胁迫升高，在SA3组达到峰值。肾中三种亚型表达均高于CG组，gpfba-a和gpfba-c在SA2组最高，gpfba-b在SA3组最高。肝中三种亚型均呈先升后降趋势，gpfba-a在SA2组最高，gpfba-b在SA1组最高，gpfba-c在SA3组最高。肌肉中gpfba-a和gpfba-b先升后降，分别在SA2和SA1组最高，gpfba-c随盐碱胁迫升高，在SA4组达峰值。FBA蛋白浓度方面，鳃中FBA含量先升后降，SA3组最高；肾中SA2、SA3、SA4组显著升高；肝和肌肉中所有盐碱处理组均显著升高，均在SA2组达到峰值。
3.3 糖代谢关键指标检测
葡萄糖含量：盐碱胁迫下鳃、肾和肝中葡萄糖水平不同程度升高，肾和肝在所有盐碱处理组均显著升高；肌肉葡萄糖在SA2、SA3、SA4组显著降低。
HK活性：鳃中HK在SA1组显著降低，SA2～SA4组显著升高；肾和肝中所有盐碱处理组均显著升高，均在SA3组最高；肌肉中HK先降后升，仅在SA4组高于CG组。
PK活性：鳃和肾中所有盐碱处理组均显著升高，鳃在SA2组最高，肾在SA1组最高；肝中PK在SA2～SA4组显著升高，SA2组最高；肌肉中PK在所有盐碱处理组均显著降低。
PEPCK含量：鳃中SA1、SA2、SA3组显著升高；肾中所有处理组均显著升高，SA2组最高；肝中SA2、SA3组显著升高，SA3组最高；肌肉中所有处理组均显著降低，SA1组最低。
G6PD含量：鳃、肾、肝和肌肉中均呈升高趋势，除肌肉SA2组升高不显著外，其余处理组均显著升高。鳃和肾中G6PD在SA3组最高，肝中在SA2组最高，肌肉中在SA4组最高。
3.4 糖代谢综合分析与讨论
以FBA含量变化倍数反映整体糖代谢强度，鳃、肾、肝和肌肉均表现出先升后降趋势，盐碱胁迫增强了四个组织的整体糖代谢强度。以PK活性代表糖酵解强度，盐碱胁迫下鳃、肾和肝糖酵解先增强后下调，均高于CG组；肌肉糖酵解下降。以PEPCK代表糖异生强度，鳃、肾和肝糖异生增强，肌肉糖异生受到抑制。以G6PD代表PPP强度，鳃、肾和肝PPP显著增强，肌肉PPP无显著变化。
讨论部分指出，gpfba-c在鳃、肾、肝和肌肉中普遍上调，推测其为响应盐碱胁迫的关键基因，其表达升高可能促进FBA蛋白合成，增强糖代谢和能量供应。鳃和肾在盐碱胁迫后需要大量能量，可能与其渗透调节功能相关；肝的高代谢与其代谢活动有关；肌肉糖酵解能力下降，同时观察到盐碱胁迫下青海湖裸鲤运动活性和运动幅度明显降低，表明其可能通过组织间能量重分配来保证生存。PEPCK在鳃、肾和肝中升高，表明糖异生能力增强，可提供多种中间代谢物；肌肉中PEPCK降低，可能减少肌糖原合成，这与其生长缓慢有关。G6PD在四个组织中均升高，表明PPP参与响应盐碱胁迫，其产物可提供合成原料并与其他代谢通路协调。
综合来看，青海湖裸鲤一方面通过增强鳃、肾和肝中的糖酵解、糖异生和PPP来支持渗透调节和物质合成，从而快速适应盐碱环境；另一方面通过抑制肌肉中的糖酵解和糖异生，将能量优先分配给鳃、肾、肝等关键渗透调节器官。青海湖天然环境的盐碱浓度正处于SA3～SA4范围，结合野外青海湖裸鲤生长极为缓慢的报道，肌肉糖代谢的抑制可能是一种"节能策略"，从能量分配角度为其生长缓慢提供了生理学解释。FBA在鳃、肾和肝中可作为糖代谢的指示标志物，但肌肉中FBA升高可能与PPP增强或其他生理过程有关，需进一步研究。
四、研究结论
本研究成功克隆了青海湖裸鲤gpfba家族完整编码区序列，并进行了基础生物信息学分析和多组织表达分析，为深入研究gpfba家族相关基因提供了基础。盐碱胁迫下，gpfba-c表达普遍上调，鳃、肾、肝和肌肉中FBA含量普遍升高，表明gpfba-c基因和FBA均响应盐碱胁迫，gpfba-c可能是FBA合成的主要基因。盐碱胁迫下，鳃、肾和肝中的糖代谢过程（糖酵解、糖异生和PPP）得到促进，表明这些组织为适应盐碱环境而增强了能量供应和代谢需求；肌肉中糖酵解和糖异生受到抑制，主要表现为鱼体运动活性降低和肌糖原合成减少，这可能导致生长延缓。该研究为全面探索青海湖裸鲤的耐盐碱机制奠定了基础，揭示了不同组织在盐碱胁迫下的差异响应模式。
