《Aquatic Toxicology》：Material-dependent physiological and biochemical responses of marine microalga
Tisochrysis sp. to three model nanoplastics
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海洋微藻对纳米塑料的生理响应仍知之甚少，现有研究几乎完全集中于聚苯乙烯纳米球，限制了对其他聚合物在纳米尺度影响的认知。为填补这一知识空白，本研究评估了实验室制备的来自聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚氯乙烯（PVC）和残留光聚合3D树脂（PU/PA）的纳米塑料
海洋微藻对纳米塑料的生理响应仍知之甚少，现有研究几乎完全集中于聚苯乙烯纳米球，限制了对其他聚合物在纳米尺度影响的认知。为填补这一知识空白，本研究评估了实验室制备的来自聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚氯乙烯（PVC）和残留光聚合3D树脂（PU/PA）的纳米塑料（<200 nm）在5 μg/mL浓度下暴露10天对海洋微藻Tisochrysis sp.的影响。研究人员测定了细胞生长动态、生化组成、光合色素含量、细胞尺寸、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，并使用主成分分析（PCA）整合数据集。结果揭示了材料依赖性的生理效应，而PCA则显示了两种不同的生理响应模式：PET和PVC暴露的细胞表现出与颗粒暴露相关的光合色素重组，而PU/PA-NPs诱导了更强的初始生长抑制（高达50%）但未能持续，同时伴随着向脂质积累的转变，反映了细胞氧化还原稳态的动态调节。
一、研究背景与研究目的
当前，塑料废弃物污染及其对环境和公共健康的影响已成为重大的社会与科学议题。塑料产业在过去73年间产量从170万吨激增至4.14亿吨，加之废弃物管理缺失以及塑料碎片化至纳米级别，使得塑料成为普遍存在的新兴污染物。海洋作为生物圈最重要的自然系统之一，覆盖地球表面约70%，其内部生物地球化学过程深刻影响着大气和陆地系统。据报道，海洋废弃物中90%为塑料，其中99%的颗粒小于5毫米（即微塑料和纳米塑料）。近期研究表明，即使在被视为原始且未受人类活动显著影响的北冰洋，纳米塑料浓度也约为0.01-0.9 μg/L；而在北大西洋整个水柱中，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚苯乙烯（PS）和聚氯乙烯（PVC）纳米塑料浓度可达1.5-32 μg/L。这些研究指出，纳米塑料是海洋塑料质量预算中最大的组分，意味着海洋塑料总质量高于此前预估。
在海水环境中，纳米塑料可与溶解性有机和无机物结合形成稳定或不稳定的聚集体，但仍可保持在纳米尺度，有效与各种生物体相互作用，尤其是构成海洋食物链基础、主要负责固定CO?并产生大气O?的海洋浮游植物。然而，已有体外研究几乎全部采用商业聚苯乙烯（PS）纳米球，实验条件（粒径、暴露时间、浓度、藻种等）差异极大，导致难以建立PS纳米颗粒与细胞效应之间的可靠关联。此外，单一聚焦于PS限制了研究的生态相关性，因为该聚合物并不能代表每年释放到环境中的多种塑料。
近期研究已将PET确定为海洋环境中最常见的污染物之一，同时一种新型污染源——来自3D打印机清洁过程的残余溶液（醇/树脂）产生的聚氨酯/聚丙烯酸酯（PU/PA）纳米颗粒——也被报道。此外，广泛用于海洋生产活动的PVC已在海洋生态系统中被鉴定为微纳米塑料。鉴于海洋中塑料的化学多样性以及浮游植物在地球平衡中的关键作用，理解它们之间的相互作用和影响至关重要。因此，本研究旨在评估具有可比物理化学性质（尺寸、形态和表面电荷）和相同浓度（5 μg/mL）的三种不同纳米塑料（PET、PVC和PU/PA）对海洋微藻Tisochrysis sp.代谢、细胞尺寸、光合色素及生化组成的影响。
二、关键技术方法
研究人员首先通过机械研磨、溶剂溶解及沉淀等方法分别制备了PET、PVC和PU/PA三种纳米塑料，并利用透射电子显微镜（TEM）表征其形貌与尺寸，傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认化学成分，动态光散射（DLS）测定流体力学直径和Zeta电位，紫外-可见分光光度法评估光学特性。随后，以5 μg/mL浓度将三种纳米塑料分别暴露于Tisochrysis sp.培养物中，在10天内于特定时间点（第4、7、10天）监测细胞生长动态（细胞计数、比生长速率、抑制率、细胞产量）、细胞尺寸与体积（ImageJ软件分析显微图像）、光合色素含量（丙酮提取后分光光度法）、生化组成（蛋白质、碳水化合物、脂质的定量分析）、脂肪酸谱（气相色谱-火焰离子化检测器分析）、活性氧水平及抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT）。此外，通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜观察细胞-纳米塑料相互作用。所有数据经统计分析（ANOVA、Welch's ANOVA、Kruskal-Wallis检验）及主成分分析（PCA）整合。
三、研究结果
3.1 纳米塑料表征
TEM显示PET-NPs和PU/PA-NPs呈不规则形状且聚集，PVC-NPs分散性更好、形状更光滑。在理想分散介质中，三种纳米塑料的流体力学直径均约为200 d.nm，Zeta电位约为-28 mV。在海水和富营养海水中，所有纳米颗粒的流体力学直径增大、Zeta电位负值减小。FTIR确认了各材料的特征化学结构。光学特性方面，在光合有效辐射（PAR）区域，PU/PA-NPs反射率最高，PVC-NPs最低；在5 μg/mL浓度下，PU/PA-NPs吸光度最高，PVC-NPs最低，但所有吸光度均低于0.1，估计微藻可利用的辐照度仍较高（PET: 97.5%, PVC: 98.7%, PU/PA: 94.2%）。
3.2 对微藻代谢的影响
3.2.1 菌株系统发育鉴定：通过18S rDNA序列分析，确认所用菌株属于Tisochrysis属，而非Isochrysis galbana sensu stricto。
3.2.2 生长与种群参数：PU/PA-NPs暴露组细胞密度在整个实验中显著较低，而PET-NPs和PVC-NPs暴露组在第7天后细胞密度增加，第10天显著高于对照组。对照组比生长速率最高（0.8±0.03），PU/PA-NPs组最低（0.6±0.03）。PET-NPs组从第7天起呈现生长促进（抑制率为负值，达37%），PVC-NPs组在整个实验中表现为持续的生长刺激（10-21%），而PU/PA-NPs组呈现明显的抑制模式（接近50%），但至第10天抑制趋近于零，表明恢复趋势。
3.2.3 细胞尺寸与体积：对照组细胞直径分布在4-7 μm，体积在70-80 μm3。第4天时，PET-NPs暴露组细胞尺寸显著最大（平均体积101.5 μm3），但从第7天起与对照组相当；PVC-NPs组在第4天也显著大于对照组，第10天缩小；PU/PA-NPs组尺寸相对恒定，但在第4天和第10天均显著大于对照组。
3.2.4 光合色素组成：对照组中，叶绿素a（Chla）占比最大，随时间略有下降，类胡萝卜素（Caro）比例逐渐上升。PU/PA-NPs组趋势与对照组相似。而PET和PVC-NPs暴露组中，Chla约占一半色素组成，Caro的相对比例显著高于对照组。
3.2.5 生化组成：对照组中蛋白质占主导，第10天脂质比例升高成为主要组分。PET-NPs组在第4天和第7天碳水化合物比例显著高于对照组；PVC-NPs组在第4天蛋白质比例最高、脂质比例最低；PU/PA-NPs组的脂质比例在所有条件和采样时间中均为最高，蛋白质和碳水化合物比例相对恒定。
3.2.6 生化体积估算：对照组生化组分占细胞体积不到20%，PET和PVC-NPs组低于15%，而PU/PA-NPs组高达25%，其中脂质所占百分比在第4天和第7天显著高于对照组。
3.2.7 脂肪酸谱：共鉴定出11种脂肪酸，按饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）分类分析，具体结果见补充图表。
3.2.8 活性氧与抗氧化酶活性：通过荧光法测定ROS，分光光度法测定SOD和CAT活性，结果反映细胞氧化应激状态。
3.2.9 细胞-纳米塑料相互作用：SEM和共聚焦显微镜观察显示纳米塑料与细胞的附着情况。
四、讨论与结论
主成分分析（PCA）整合了所有数据，揭示出两种不同的生理响应模式：PET和PVC暴露的细胞呈现出与颗粒暴露相关的光合色素重组，而PU/PA-NPs则诱导了更强的初始生长抑制（高达50%）但未能持续，并伴随向脂质积累的转变，反映出细胞氧化还原稳态的动态调节。研究结果表明，纳米塑料对海洋微藻的影响具有材料依赖性，不同聚合物引发截然不同的生理和生化响应。这强调了在研究纳米塑料生态毒性时，必须超越传统的聚苯乙烯模型，纳入更多种类的环境相关聚合物。本研究的发现对于理解纳米塑料对海洋初级生产力的潜在影响具有重要意义，并为未来风险评估提供了关键数据支撑。
