《Genes》：Genome-Wide Identification and Expression Analysis of Sucrose Phosphate Synthase, Sucrose Synthase, and Invertase in Carrot (Daucus carota L.)
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背景：植物体内的碳分配与能量供应主要由蔗糖代谢决定，而蔗糖代谢受蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase, SPS）、蔗糖合成酶（sucrose synthase, SUS）和转化酶（invertase, INV）协同调控。胡萝卜（
背景：植物体内的碳分配与能量供应主要由蔗糖代谢决定，而蔗糖代谢受蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase, SPS）、蔗糖合成酶（sucrose synthase, SUS）和转化酶（invertase, INV）协同调控。胡萝卜（Daucus carota L.）是世界范围内重要的经济根菜作物。作为主要的运输和贮藏二糖，蔗糖依据其积累水平调节根部渗透势和甜度。然而，胡萝卜中SPS、SUS和INV基因家族的全基因组特征，以及它们在不同发育阶段和胁迫条件下的表达动态，仍不清楚。方法：研究人员在本研究中鉴定了胡萝卜中这些基因家族，并对其系统发育关系、基因结构、保守蛋白基序、染色体分布以及不同发育阶段和胁迫诱导剂非生物处理下的表达谱进行了分析。结果：在胡萝卜中共鉴定到5个SPS、8个SUS和19个INV基因。系统发育分析显示，同一亚家族成员具有相似的外显子–内含子结构和保守基序组成。片段重复（segmental duplication），而非串联重复（tandem duplication），是家族扩张的主要驱动力。转录谱分析显示，DcSPS、DcSUS和DcINV旁系同源基因在不同组织和发育阶段表现出多样的时空表达特征，其中多个基因在肉质根膨大期被强烈激活。在非生物胁迫下，这些基因受到差异性的转录调控，且多个成员在NaCl或外源ABA处理下表现出显著诱导。结论：综上，这些发现提供了胡萝卜SPS、SUS和INV基因家族的全面名录，并产生了关于它们在蔗糖代谢中潜在作用的可检验假说。所鉴定的基因及其表达谱为今后功能研究和该作物基于蔗糖的品质改良提供了宝贵的遗传资源。
胡萝卜（Daucus carota L.）是世界性重要根菜作物，肉质根中可溶性糖尤其是蔗糖的积累直接影响其风味、营养品质与市场表现。蔗糖代谢由蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SUS）和转化酶（INV）协同调控，这三类酶在碳分配、源–库关系和非生物胁迫响应中发挥关键作用。尽管拟南芥、水稻、番茄等物种中这些基因家族已被系统研究，但胡萝卜中SPS、SUS和INV家族的全基因组特征、发育阶段表达动态及胁迫响应仍不明确，此前仅报道了少量DcSUS基因。为此，研究人员开展了胡萝卜这三个基因家族的全基因组鉴定与表达分析，旨在揭示其进化特征和潜在功能，为胡萝卜蔗糖代谢机制研究和品质改良提供候选基因资源。该研究共鉴定出5个DcSPS、8个DcSUS和19个DcINV基因；系统发育与结构分析表明这些家族成员在进化中受到纯化选择，片段重复是家族扩张的主要驱动力；组织、发育阶段及NaCl和ABA处理下的表达分析显示，这些基因具有多样的时空表达特征和胁迫响应模式。这些结果系统补充了胡萝卜蔗糖代谢基因家族信息，为后续功能验证和分子育种提供了理论基础。
研究人员采用的技术方法主要包括：从NCBI下载胡萝卜基因组、蛋白及注释数据；以Pfam的PF00534、PF00862、PF05116、PF12899等HMM模型和拟南芥已知蛋白为查询序列，在TBtools-II v2.322中通过HMM Search和BLASTP筛选候选基因，并经NCBI-CDD和InterPro验证保守结构域；用MEGA-X对胡萝卜、拟南芥和水稻蛋白构建最大似然系统发育树；用MEME预测保守基序；用MCScanX和TBtools-II进行染色体定位、共线性和Ka/Ks分析；用PlantCARE预测启动子顺式作用元件。表达分析利用NCBI SRA数据库SRP062159中20份胡萝卜组织RNA-seq数据，并在‘Sanhong’和‘Yizhila’两个品种上进行qRT-PCR验证，检测60、80、100、120天发育阶段以及150 mM NaCl和50 μM ABA处理后根和叶中的表达，以Actin和5.8S rRNA为内参，按2
?ΔΔCt法计算相对表达量。
3.1 胡萝卜SPS、SUS和INV基因的鉴定
通过HMM筛选与BLASTP比对并联合NCBI-CDD验证，研究人员在胡萝卜基因组中鉴定到5个SPS、8个SUS和19个INV基因。其中19个INV包括13个酸性转化酶（AINV）和6个碱性/中性转化酶（NINV），酸性转化酶又分为10个细胞壁转化酶（DcINVCW）和3个液泡转化酶（DcINVVR）。蛋白理化性质分析显示，DcSPS蛋白均为不稳定亲水蛋白，多数DcSUS蛋白为稳定亲水蛋白，DcINV家族蛋白大多为稳定的亲水蛋白；亚细胞定位预测显示这些蛋白分布于细胞核、叶绿体、细胞质等不同部位，提示功能可能发生分化。
3.2 SPS、SUS和INV家族系统发育分析
基于最大似然法构建的系统发育树显示，SPS家族分为A、B、C、D四个亚家族，胡萝卜DcSPS分布于A、B、C亚家族，未发现禾本科特有的D亚家族；SUS家族分为SUSI、SUSII、SUSIII三个亚家族，胡萝卜成员均聚入相应分支；AINV和NINV分别构建系统发育树后，胡萝卜DcINVAN成员分属α和β亚家族，且α亚家族成员具有较长的N端延伸区。系统发育关系表明胡萝卜这些基因家族与拟南芥、水稻既有保守性，也存在物种特化。
3.3 保守结构域、保守基序与基因结构
保守结构域分析显示，所有DcSPS均含有Glycos_transf_1、Sucrose_synth和S6PP结构域；所有DcSUS均含有Sucrose_synth和Glycos_transf_1结构域；DcINVVR和DcINVCW含有Glyco-hydro-32N和Glyco-hydro-32C结构域，其中DcINVVR还独有DUF3357结构域；DcINVAN均含有Glyco-hydro-100结构域。基因结构分析表明，同一亚家族成员通常具有相似的外显子–内含子组成，但部分成员出现外显子缺失或插入，例如DcSPS5缺失第2外显子、DcSPS2在第4内含子区插入外显子，这些结构变异可能为功能分化提供了基础。
3.4 染色体定位与共线性分析
染色体定位显示，5个DcSPS基因分别位于3、4、5、6、7号染色体；8个DcSUS基因分布在1、3、4、7、8号染色体；19个DcINV基因不均等地分布在7条染色体上。共线性分析在胡萝卜与拟南芥之间分别鉴定到3个SPS、6个SUS和17个INV共线性基因对，与水稻之间分别鉴定到1个SUS和4个INV共线性基因对，表明部分基因在单、双子叶分化前已存在。
3.5 复制事件与Ka/Ks分析
基因复制事件分析显示，DcSPS家族存在2对片段重复基因；DcSUS家族存在1对片段重复和2对串联重复基因；DcINV家族存在10对片段重复和2对串联重复基因。所有重复基因对的Ka/Ks值均小于1，表明这些基因家族在进化过程中经历了强烈的纯化选择，片段重复是家族扩张的主要方式。
3.6 启动子顺式作用元件分析
对翻译起始位点上游2000 bp启动子区域的预测共发现54种顺式作用元件。除TATA-box和CAAT-box外，这些元件可分为光响应、激素响应、胁迫响应和生长发育相关四类。光响应元件数量最多；脱落酸响应元件（ABRE）分布最广，部分基因含有5–7个ABRE；除DcSPS1和DcINVAN6外，其余基因启动子均包含四类元件，提示这些家族受多种信号通路协同调控。
3.7 胡萝卜SPS、SUS和INV基因组织特异性表达分析
基于NCBI中20份胡萝卜组织RNA-seq数据的分析显示，DcSPS1在芽、愈伤组织和受胁迫根中表达较高，DcSPS2在花和叶中高表达；DcSUS1、DcSUS2和DcSUS8整体表达水平较高，主要分布于根韧皮部、根木质部、纤维根和叶片；DcINVCW6在纤维根中优势表达，DcINVVR2在非胁迫叶片和受胁迫根中表达较高，DcINVAN1在多种组织中广泛表达。进一步对‘Sanhong’品种60、80、100和120天根、叶的qRT-PCR分析显示，DcSPS1在根中的表达随发育逐渐上升并在120天达到峰值；DcSPS2在80天叶片和根中均显著升高；DcSUS1、DcSUS2在100天叶片中达到峰值，恰对应肉质根快速膨大期；DcINVVR3主要在根中表达，多个INV成员在特定发育阶段出现明显上调。这些结果说明三个基因家族在胡萝卜营养器官和肉质根发育过程中表现出不同的时空表达模式。
3.8 环境与激素信号处理下的表达响应分析
对‘Yizhila’品种进行150 mM NaCl处理后，DcSPS基因在根中普遍呈现先短暂上调后下降的趋势，在叶片中相对稳定；DcSUS家族对盐胁迫总体响应较弱；DcINV家族表现出亚家族特异性响应，DcINVAN2和DcINVAN5在根中6小时显著上调，但在叶片中呈相反趋势。经50 μM ABA处理后，叶片中DcSPS家族表达总体下调，根中DcSPS2随处理时间逐渐上调；DcSUS家族对ABA处理响应不明显；所有被检测的DcINV成员在根中均出现响应，其中DcINVVR1、DcINVVR2、DcINVAN2和DcINVAN5在处理后6小时显著上调，DcINVVR3、DcINVCW7和DcINVAN1在处理后24小时上调，而叶片中DcINVVR1、DcINVVR3和DcINVCW7表达下调。这些结果表明蔗糖代谢基因在盐胁迫和ABA信号下存在差异化的转录调控。
讨论部分系统总结了三个基因家族的进化特征和表达规律：胡萝卜SPS家族规模较小且不含单子叶特有的D亚家族；SUS家族经片段重复和串联重复扩张并受到纯化选择；INV家族成员数量与番茄相近，DUF3357结构域可能是液泡转化酶功能特异性的结构基础，α和β亚家族NINV在亚细胞定位和基因结构上存在分化。结合组织表达谱，研究人员认为DcSPS、DcSUS和DcINV家族协同参与胡萝卜肉质根发育过程中的蔗糖源–库分配，其中部分成员可能在维管组织发育、液泡糖稳态和块根碳供应中发挥重要作用；启动子中丰富的ABRE等元件与其在NaCl和ABA处理下响应表达相互印证。
研究结论可概括为：本研究在胡萝卜中鉴定出5个DcSPS、8个DcSUS和19个DcINV基因。系统发育分析表明片段重复是家族扩张的主要驱动力，家族成员受到纯化选择。转录组和qRT-PCR分析显示胡萝卜SPS、SUS和INV家族成员具有明显的组织特异性表达模式，SPS和INV成员表现出不同的组织偏好表达，SUS基因主要在叶和根中表达，表明这三个家族在器官发育过程中协同调节蔗糖源–库分配。这些家族表现出不同的胁迫响应：根中DcSPS1、DcSPS2和DcSPS5在NaCl处理后先短暂上调后受抑制，DcSPS2受ABA持续诱导，SUS基因对
