《Genes》：DNA Methylation Alterations in Patients with Moderate-to-Severe Thyroid Eye Disease Treated with Intravenous Glucocorticoids
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背景/目的：甲状腺眼病（thyroid eye disease, TED）中的全基因组表观遗传学改变仍未得到充分表征，尤其是在静脉注射糖皮质激素（intravenous glucocorticoid, ivGC）治疗背景下。研究人员旨在表征活动性、中重度TED
背景/目的：甲状腺眼病（thyroid eye disease, TED）中的全基因组表观遗传学改变仍未得到充分表征，尤其是在静脉注射糖皮质激素（intravenous glucocorticoid, ivGC）治疗背景下。研究人员旨在表征活动性、中重度TED患者的全基因组DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）改变，并评估ivGC治疗后观察到的DNAm模式差异及其与临床应答的关系。方法：研究人员入组了24名甲状腺功能正常的中重度TED患者和7名健康对照（healthy controls, HC）。采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）在ivGC治疗前（TED-P1）和治疗后12周（TED-P2）对外周全血进行DNAm谱分析，并将两个时间点与同一HC参考组进行比较。此外，在个体水平上探索了患者内部的DNAm变化。基因集富集（gene set enrichment, GSE）分析研究了所鉴定甲基化改变的生物学背景。结果：在TED患者与HC之间鉴定出全基因组和位点特异性DNAm差异，且以低甲基化显著为主。主成分分析显示TED患者与HC分离，且治疗后观察到聚类模式差异。GSE鉴定出与免疫调节、细胞周期控制以及（在其他类别中）视觉系统发育相关的通路富集。针对吸烟状况和年龄的敏感性分析支持主要低甲基化模式的持续性。探索性分析提示，根据累积ivGC暴露量，治疗后DNAm模式存在差异，但本研究队列中未鉴定出与临床治疗应答相关的一致DNAm特征。结论：中重度TED患者表现出以低甲基化为主和功能性相关通路富集为特征的全基因组及位点特异性DNAm改变。这些发现需要在更大规模的独立队列中进行验证。
中重度甲状腺眼病患者静脉糖皮质激素治疗后的DNA甲基化改变：一项基于全基因组测序的前瞻性队列研究
一、研究背景与问题
甲状腺眼病（thyroid eye disease, TED）是Graves病（Graves' disease, GD）最主要的内分泌眼病表现，其发病机制涉及遗传、环境及内源性因素，并与促甲状腺激素受体抗体（TSH receptor autoantibodies, TRAb）驱动的自身免疫反应密切相关。TED的临床病程和严重程度具有高度异质性，部分患者对标准静脉注射糖皮质激素（intravenous glucocorticoids, ivGC）治疗反应不佳。目前，关于TED的表观遗传学机制尤其是全基因组DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）改变仍所知甚少，既往研究多局限于特定基因位点，且几乎未关注治疗过程中DNAm的动态变化。因此，研究人员开展了一项前瞻性研究，旨在系统表征活动性中重度TED患者外周全血中的全基因组和位点特异性DNAm改变，并评估ivGC治疗对DNAm模式的影响及其与临床应答的关联。
二、研究设计与主要结论
该研究入组了24名活动性中重度TED患者和7名健康对照（healthy controls, HC）。采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）对治疗前（TED-P1）及治疗后12周（TED-P2）的外周血样本进行DNAm分析。主要发现包括：TED患者与HC之间存在广泛的全基因组DNAm差异，以低甲基化显著为主；治疗后DNAm聚类模式发生改变，但低甲基化仍是主导模式；基因集富集分析（gene set enrichment, GSE）揭示免疫调节、细胞周期控制和视觉系统发育等通路富集；未发现与临床治疗应答相关的一致DNAm特征。这些发现提示DNAm改变可能参与TED的发病机制，并可能受ivGC治疗影响，但其作为生物标志物的潜力仍需更大规模独立队列验证。
三、关键技术方法
研究人员使用RRBS技术对24例TED患者（治疗前后双时间点）和7例HC的外周全血DNA进行全基因组甲基化测序，测序平台为Illumina NovaSeq 6000，采用双端150 bp读长。数据分析包括鉴定差异甲基化胞嘧啶（differentially methylated cytosines, DMCs）和差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs），并通过GSE分析生物学通路富集。敏感性分析针对吸烟状态、年龄及外周血白细胞组成进行校正。研究经华沙医科大学伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。
四、研究结果
1. 受试者特征与临床结局：共入组24例活动性中重度TED患者，其中58.33%的患者经ivGC治疗后达到临床应答标准。应答者治疗后临床活动度评分（Clinical Activity Score, CAS）、眼睑退缩和眼球突出均显著改善。
2. 全基因组DNAm模式：TED-P1患者与HC之间的平均DNAm差异为-13.14%，且在所有常染色体上均观察到低甲基化趋势。PCA显示TED-P1与HC明显分离。TED-P2与HC比较的平均DNAm差异为-12.51%，PCA仍显示分离但聚类模式发生改变，部分治疗后样本与HC重叠。
3. 位点特异性DNAm改变：TED-P1与HC比较共鉴定出2894个显著DMCs，其中99.17%为低甲基化，并对应2786个DMRs。TED-P2与HC比较共鉴定出770个显著DMCs，低甲基化仍占绝对优势，对应767个DMRs。启动子区和CpG岛是最常见的差异甲基化基因组区域。
4. 功能富集分析：TED-P1与HC比较共鉴定出26个显著富集的GO条目和16条KEGG通路，涉及视觉系统发育、细胞周期调控、Rap1信号和钙信号通路等。TED-P2与HC比较鉴定出8个GO条目，包括与GABA能分化相关的神经元通路。
5. 敏感性分析：在仅纳入不吸烟者的分析中，TED与HC之间的低甲基化主导模式保持不变（8251个低甲基化DMCs vs 29个高甲基化DMCs）。年龄校正后该模式仍然存在。配对血常规分析未发现治疗前后中性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞比例发生系统性变化。
6. 治疗应答与临床关联：PCA未能显示应答者与非应答者之间的清晰分离。探索性个体水平分析显示治疗前后存在大量患者内部DNAm改变，但应答者与非应答者之间的显著DMCs总数无差异。按累积ivGC剂量分层时，7.5 g剂量组（n=6）表现出以高甲基化为主的模式，而4.5 g剂量组表现为低甲基化为主。
五、讨论与结论
既往研究曾在GD和TED中报道过全基因组DNAm改变，但关于ivGC治疗过程中的纵向表观遗传学变化数据有限。本研究的低甲基化主导模式与早期一项采用RRBS的中国TED队列研究结果一致，并进一步观察到治疗后DNAm模式的动态变化。虽然未发现与临床应答一致的DNAm指纹，但这可能与样本量有限、TED临床异质性以及分析策略严格（预设甲基化差异≥25%）有关。累积ivGC剂量分层分析提示糖皮质激素暴露量可能影响DNAm模式，但由于高剂量组样本量过小，不能得出剂量依赖性结论。此外，年龄、吸烟状态和细胞组成是重要的潜在混杂因素，尽管敏感性分析支持主要发现的稳健性，但正式的结合位点反褶积分析仍缺失。
本研究的核心贡献在于：这是少数采用RRBS对TED进行全基因组甲基化分析的研究之一，也是首个在活动性中重度TED患者中前瞻性评估ivGC治疗前后DNAm动态变化的研究。研究结论为：中重度TED患者存在以低甲基化为主要特征的全基因组和位点特异性DNAm改变，ivGC治疗可影响该模式但未改变其主导方向；DNAm改变涉及免疫调节、细胞周期和视觉系统发育等关键生物学通路；未发现可预测临床应答的一致甲基化特征。上述发现需要在更大规模的独立纵向队列中验证，以明确DNAm在TED发病机制和治疗结局中的潜在作用。
