《Genes》：Two Transcriptomic Analyses Converge on a Five-Gene Core for Colorectal Cancer Discrimination: External Validation in Independent Tissue Cohorts
编辑推荐：
背景/目标：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球肿瘤相关发病率和死亡率的主要原因之一，也是墨西哥癌症死亡的首要原因；在该国，早期检测仍是一项挑战，而可靠的分子生物标志物可支持更早诊断。CRC的转录组特征已有发表，但不同研究得出的基因列
背景/目标：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球肿瘤相关发病率和死亡率的主要原因之一，也是墨西哥癌症死亡的首要原因；在该国，早期检测仍是一项挑战，而可靠的分子生物标志物可支持更早诊断。CRC的转录组特征已有发表，但不同研究得出的基因列表几乎不重叠；由于每项研究在队列和分析方法上均不相同，因此无法确定这种分歧的来源。本研究旨在识别一组用于CRC鉴别的基因集，其筛选既不依赖于批次效应的处理方式，也不依赖于候选基因的筛选标准，并在未参与该基因集筛选的公共数据储存库中对其进行验证。方法：该特征在来自NCBI Sequence Read Archive六个BioProject的104份公共RNA-seq样本（79份肿瘤，25份参照）中识别，并进行两次分析。功能锚定路径从包含BioProject作为协变量的差异表达模型中，按π值排序，从每个富集的生物学程序中选取一个代表性基因；正则化路径则在ComBat-Seq校正后的矩阵上，通过嵌套交叉验证，根据基因在弹性网络（Elastic Net）下的稳定性筛选基因。两条路径共同获得的基因在经recount3处理的TCGA-COAD、TCGA-READ和GTEx结肠数据（n = 1542）中进行了验证，所有参数均固定不变；并在GEO微阵列系列GSE37364（94份样本系列中的65份癌和正常黏膜样本）中验证，由于平台不同，仅转移了系数向量；此外，还在第二个腺瘤系列（GSE89076）、已发表的粪便RNA-seq和血浆细胞游离RNA中进行了描述性检验。结果：两条路径分别产生了一个七基因特征和一个五基因特征，两者共享一个基因RPGRIP1L。五个基因同时满足两个标准：TRIP13、CEMIP、PUS7、RPGRIP1L和SLC22A3。在所有参数固定不变的情况下，五基因核心在TCGA/GTEx中的AUC为0.9993（敏感性0.966，特异性0.998）；在转移系数并重新校准截距后，在GSE37364中的AUC为0.9737（敏感性0.926，特异性0.974）。在GSE37364中，这五个基因相对于正常黏膜在腺瘤中均升高；在GSE89076中，由于仅有5个腺瘤样本，五个基因中的三个达到显著性；在已发表的CRC患者粪便RNA-seq中，五个基因均过表达。结论：五基因核心TRIP13、CEMIP、PUS7、RPGRIP1L和SLC22A3能在未参与其筛选的外部储存库中区分结直肠肿瘤组织与非肿瘤组织，且在癌前腺瘤中已出现升高。由于这五个基因是通过两条既无共同标准也无共同起点的路径获得的，它们可作为实验验证和无创可及材料评估的优先候选基因。
结直肠癌（CRC）是全球肿瘤相关发病和死亡的重要原因，也是墨西哥癌症死亡的首位原因。结肠镜虽为金标准，但其侵入性、肠道准备和镇静需求影响患者依从性；无创检测在敏感性与可及性之间存在权衡，尤其对癌前病变的检出率较低。转录组特征可作为另一类分子生物标志物，但既往已发表的CRC转录组特征基因列表重叠极少，且各项研究在队列和分析方法上均不相同，无法判断分歧来自队列还是方法。本研究通过固定样本、仅改变分析策略，旨在识别一个既不受批次效应处理方式影响、也不受候选基因筛选标准影响的基因集，并在未参与筛选的公共数据中进行外部验证。
研究人员从NCBI Sequence Read Archive的六个BioProject获得104例公共RNA-seq样本（79例肿瘤，25例参照），进行两次独立分析。路线A（功能锚定）在DESeq2模型中以BioProject为协变量，对过表达基因进行通路富集，每个生物学程序选取π值最高的代表基因；路线B（正则化）用ComBat-Seq校正计数矩阵，通过弹性网络（Elastic Net）嵌套交叉验证筛选在所有折叠中稳定的基因。两路线的交集得到五基因核心，并在TCGA-COAD、TCGA-READ和GTEx结肠组织（recount3处理，n = 1542）以及GEO微阵列系列GSE37364（65例癌和正常黏膜样本）中进行外部验证。
结果部分如下。
3.1 合并队列中的差异表达：保留37,420个基因，肿瘤与参照比较共识别6748个差异表达基因（3018个过表达，3730个低表达）；主成分分析显示肿瘤与参照沿PC1分离，且样本在条件内按BioProject聚集，提示存在技术批次结构。
3.2 探索性功能富集：过表达基因在Reactome、KEGG和Hallmark等集合中富集出增殖程序（ATR、细胞周期检查点、DNA合成），以及核糖体生物发生、tRNA加工、未折叠蛋白反应、纤毛组装、溶质转运和核膜相关程序；这些被归纳为7个生物学程序。
3.3 路线A候选基因与代表特征：7个程序共有26个候选基因，其中增殖程序占15个；每个程序按π值选出代表基因，构成七基因面板。
3.4 ComBat-Seq批次效应校正：对计数矩阵进行ComBat-Seq调整后，PC1解释方差从30%升至44%，并与肿瘤/参照对比对齐，参照样本形成单一组。
3.5 候选基因在两种批次处理间的一致性：26个候选基因在BioProject协变量模型和ComBat-Seq校正矩阵两种策略下均保持相同方向和log
2倍数变化≥1，且逐个剔除BioProject后结论不变。
3.6 路线A代表特征：七基因面板在分层五折交叉验证中的AUC为0.9863，敏感性0.949，特异性0.960；TRIP13、CEMIP和SLC22A3的标准化系数最大。
3.7 路线B特征：从2686个过表达基因中，弹性网络在十个折叠中均选出的基因有21个；固定大小模型从5个基因起达到近似最大AUC，最终五基因签名为RPGRIP1L、ETV4、BMAL2、PPM1H、AJUBA，嵌套交叉验证AUC为0.999。
3.8 收敛核心：5个基因（TRIP13、CEMIP、PUS7、RPGRIP1L、SLC22A3）同时是路线A的程序代表和路线B的全折叠稳定基因，超几何检验p = 3.6 × 10
-10。
3.9 收敛核心的外部验证：在TCGA/GTEx中，固定所有参数（标准化常数、系数、截距、阈值）的模型达到AUC 0.9993（敏感性0.966，特异性0.998）；在GSE37364中，仅转移系数向量并重新校准截距，AUC为0.9737（敏感性0.926，特异性0.974）。
3.10 收敛核心在腺瘤、粪便和血浆中的行为：在GSE37364中，5个基因在腺瘤中均高于正常黏膜；在GSE89076中，CEMIP、TRIP13和PUS7在腺瘤中显著升高；在已发表的粪便RNA-seq中，5个基因在CRC患者中均过表达；在血浆细胞游离RNA中，TRIP13和PUS7无可评估信号，CEMIP和RPGRIP1L的方向与组织相反。
讨论指出，两条路线在设计上互不相同，却收敛于同一组基因，表明其筛选结果不太可能来自单一分析流程的假象。外部验证中，TCGA/GTEx模型所有参数固定，GSE37364换用芯片平台并仅转移系数，判别力仍然保持，说明该核心的区分能力不局限于发现队列和测量平台。内部性能估计因基因选择与交叉验证共用同一批样本而偏乐观；TCGA/GTEx中肿瘤与非肿瘤来自不同研究，条件与来源存在混杂；GSE37364样本量小，AUC置信区间较宽。血浆cfRNA中信号方向与组织不一致，提示该材料不适用于这些转录本。腺瘤和粪便的结果提示该
