《Behavioural Brain Research》：Role of dopaminergic projections from ventral tegmental area to paraventricular thalamus in heroin-induced behavioural sensitization of rats
编辑推荐：
•化学遗传学抑制VTA→PVT多巴胺能投射（而非VTA→VMH通路）可减弱海洛因敏化表达，表明PVT是超越传统VTA→NAc框架的一个新型环路靶点。•通过反义寡核苷酸在VTA内阻断M5受体可抑制海洛因敏化表达，并改变PVT和VMH中的p-CREB水平，直接将M5受体与阿片类引
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化学遗传学抑制VTA→PVT多巴胺能投射（而非VTA→VMH通路）可减弱海洛因敏化表达，表明PVT是超越传统VTA→NAc框架的一个新型环路靶点。
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通过反义寡核苷酸在VTA内阻断M5受体可抑制海洛因敏化表达，并改变PVT和VMH中的p-CREB水平，直接将M5受体与阿片类引起的长期行为可塑性联系起来，为阿片类以外的药物治疗提供了新的理论基础。
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化学遗传学抑制VTA→PVT多巴胺能投射可逆转PVT中p-Akt-308的降低和p-CREB的升高，证明该通路可能通过Akt/CREB信号轴将多巴胺能输入转化为转录调控，从而弥合了环路层面与分子机制之间的鸿沟。
引言
成瘾药物的敏化特性被认为对觅药行为的持续性具有重要贡献[1]。反复给药可诱导"行为敏化"（运动反应增强），这反映了大脑奖赏环路的高敏感性，是模拟成瘾中海洛因渴求加剧的关键动物模型[2]。中脑多巴胺能系统从腹侧被盖区（VTA）到伏隔核（NAc）的投射是药物奖赏和觅药行为的关键通路[3]。长期暴露于吗啡已被证明可增加VTA神经元中脑源性神经营养因子（BDNF）的水平并降低蛋白激酶B（Akt）的水平，向VTA中鞘外灌注BDNF可增强药物敏化和线索诱导的觅药行为[4]、[5]。此外，VTA中BDNF的过表达显著增加了其下游靶标环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）在VTA和NAc中的表达[6]。研究表明，对药物刺激的反应性增强与VTA脑区的瞬时多巴胺能活性密切相关[7]。
胆碱能系统通过M2/M4/M5毒蕈碱型乙酰胆碱受体调节多巴胺信号传导，与精神疾病和成瘾的机制密切相关，具有重要的临床靶向价值[8]。将胆碱能激动剂卡巴胆碱微量注射到VTA中可同时诱导奖赏相关效应和显著的运动活动，同时激活多个脑区[9]。一项研究表明，在大鼠VTA中灌注靶向M5受体mRNA的反义寡核苷酸可提高脑刺激奖赏的阈值[10]。M5受体几乎仅表达于VTA和 substantia nigra（黑质）的多巴胺能神经元中。这一定位使其非常适合调节多巴胺信号传导及相关行为。M5负别构调节剂ML375可显著减少电刺激引起的NAc中多巴胺释放[11]。VTA中的M5受体介导了动机诱导的快感缺失、焦虑样和抑郁样行为效应[12]。
室旁丘脑核（PVT）是一个中线丘脑区域，已被发现是调节情绪、动机、应激反应和药物相关行为的关键神经环路枢纽[13]、[14]。从解剖学上看，PVT被发现向NAc发送密集的投射[15]、[16]。PVT中表达促肾上腺皮质激素释放因子的神经元整合了腹内侧下丘脑（VMH）的输入，并通过向NAc的投射在奖赏-威胁冲突中抑制觅食行为[17]。抑制PVT-NAc通路或其下游对应的NAc-外侧下丘脑（LH）通路可消除阿片类药物相关记忆并提供持久的防复吸保护[18]、[19]。PVT向NAc壳部的神经投射在慢性食物限制诱导的海洛因觅药行为增强中发挥关键作用[20]。我们的初步发现表明，VTA向PVT的多巴胺能投射可抑制线索诱导的海洛因觅药行为[21]。几项研究表明，VMH神经元及其向PVT的投射的激活可调节摄食量[22]、[23]。然而，VTA向PVT或VTA向VMH的投射在海洛因敏化中的作用尚不清楚。
因此，本研究首先将M5受体寡核苷酸微量注射到VTA中，观察其对海洛因敏化及相关脑区CREB磷酸化表达的影响。随后，采用AAV2/Retro逆向病毒示踪结合免疫荧光共染色，检测投射至PVT和VMH的VTA神经元的表型。最后，使用通过酪氨酸羟化酶（TH）启动子元件特异性靶向多巴胺能神经元的化学遗传学病毒进行化学遗传学操作[24]、[25]，以控制VTA向PVT或VTA向VMH的多巴胺能投射。本研究旨在检验以下假设：VTA多巴胺神经元上的M5受体可调节VTA-PVT或VTA-VMH多巴胺能信号传导，从而促进海洛因敏化。
各节摘要
动物
雄性Sprague-Dawley大鼠（体重250–300 g，7–8周龄）购自浙江省实验动物中心（中国杭州）。所有大鼠饲养在温度可控的恒温室中，采用12小时颠倒光暗周期（19:00开灯，07:00关灯）。自由采食和饮水。实验设计经宁波大学实验动物使用与护理伦理委员会批准，所有实验均按照相关规范进行。
反复小剂量海洛因诱导行为敏化
图1A展示了海洛因诱导行为敏化及VTA内M5受体寡核苷酸微量注射的实验程序。图1B展示了第1天至第8天60分钟内的运动活动距离。双因素方差分析显示距离存在显著差异，但时间和交互效应均不显著。与对照组（Con）相比，海洛因组（Heroin）、M5AS组和M5S组从第1天到第8天的运动距离均显著增加。该结果表明……
讨论
在本研究中，我们发现将M5受体反义寡核苷酸微量注射到VTA中可显著抑制大鼠海洛因敏化的表达，同时伴随PVT和VMH脑区CREB磷酸化的增加。通过逆向示踪结合免疫荧光染色，我们发现了VTA向PVT或VMH的多巴胺能投射，各占不同的比例。化学遗传学抑制VTA-PVT多巴胺能投射……
结论
总之，我们发现VTA中的M5受体是调节海洛因敏化的关键受体。VTA向PVT的多巴胺能投射在海洛因敏化的表达中发挥关键作用，且该效应与Akt/CREB信号通路的磷酸化有关。
伦理声明
本研究遵循以下动物福利和/或报告指南：《实验动物饲养与使用指南》：第八版。（华盛顿特区：国家学院出版社）。本研究经宁波大学实验动物使用与护理伦理委员会批准。（批准号：AEWC-NBU20220204）
CRediT作者贡献声明
刘慧芬：撰写——审阅与编辑，形式分析，概念构思。娄中泽：撰写——审阅与编辑，经费获取，形式分析，概念构思。朱华强：撰写——初稿，验证，方法论，经费获取，形式分析，数据整理。傅丹：方法论。徐文婧：方法论，经费获取。洪青霄：方法论，经费获取。许泽民：方法论。周一莺：撰写——初稿，方法论，形式分析，
利益冲突声明
作者声明，不存在可能被认为会影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究受浙江省自然科学基金（LTGY24H090009, LQ24H090002, LQN26H090012）、浙江省医药卫生科技计划项目（2023KY296）及宁波市自然科学基金（2023J045, 2022J207）资助。
朱华强 | 周一莺 | 许泽民 | 高磊 | 李兰帆 | 洪青霄 | 徐文婧 | 傅丹 | 娄中泽 | 刘慧芬
