《Bioactive Materials》：Aptamer-functionalized EGCG nanocarrier for neutrophil-targeted AKBA delivery promotes anxiety-related fracture healing
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慢性束缚应激（CRS）诱导的焦虑通过扩增TGFβ1?CCR5?双阳性中性粒细胞亚群延迟骨折愈合，其中涉及YAP1–USP31–NF-κB–CCR5信号轴。乙酰基-11-酮基-β-乳香酸（AKBA）直接结合YAP1以上调去泛素化酶USP31，进而抑制NF-κB磷
慢性束缚应激（CRS）诱导的焦虑通过扩增TGFβ1?CCR5?双阳性中性粒细胞亚群延迟骨折愈合，其中涉及YAP1–USP31–NF-κB–CCR5信号轴。乙酰基-11-酮基-β-乳香酸（AKBA）直接结合YAP1以上调去泛素化酶USP31，进而抑制NF-κB磷酸化及CCR5表达，显著减少该致病性中性粒细胞亚群。研究人员开发了NIMP-R14适配体修饰的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）纳米载体系统（AKBA@E-N），以增强中性粒细胞摄取并实现骨折微环境响应的药物释放。体内实验证实，AKBA@E-N能够有效加速焦虑小鼠的骨折愈合。该研究阐明了焦虑相关骨折延迟的新机制，并为心理应激相关骨修复障碍提供了具有转化潜力的靶向治疗策略。
**焦虑相关骨折延迟愈合的机制与靶向治疗研究解读**
**研究背景与目的**
骨折延迟愈合或不愈合是骨科最具挑战性的并发症之一，其发病机制远超局部组织损伤范畴。流行病学与临床证据一致表明，合并焦虑或抑郁的患者表现出更显著的骨量丢失、更高的骨折发生率和更漫长的愈合周期。然而，焦虑调控骨折愈合的分子机制在很大程度上仍是未知数，且目前缺乏针对性的治疗策略。
骨折愈合由精细调控的炎症反应启动。中性粒细胞作为最早到达损伤部位的免疫细胞，其功能取向在很大程度上决定了修复的最终走向。在功能异质性的中性粒细胞库中，TGFβ1?CCR5?双阳性亚群已被鉴定为骨代谢的关键调控者，是小鼠骨髓中TGFβ1的主要来源，并在年龄相关性骨丢失中异常扩增，直接驱动骨量减少。然而，焦虑这种临床常见负性情绪状态是否通过该骨特异性致病中性粒细胞亚群的异常扩增而延迟骨折愈合，此前完全未知。
针对上述问题，研究人员采用CRS诱导的焦虑小鼠模型合并股骨骨折，证实焦虑显著扩增骨髓中TGFβ1?CCR5?双阳性中性粒细胞，并伴随明显的骨折愈合受损。机制上，CRS通过激活中性粒细胞NF-κB-CCR5信号轴驱动该亚群积聚。研究人员进一步聚焦于乙酰基-11-酮基-β-乳香酸（AKBA），一种源自乳香树脂的五环三萜类化合物，发现其通过靶向YAP1上调泛素特异性肽酶31（USP31），继而抑制NF-κB磷酸化及CCR5表达。鉴于AKBA水溶性差、生物利用度低和缺乏组织选择性，研究人员设计了NIMP-R14适配体修饰的EGCG纳米载体系统（AKBA@E-N），实现增强的中性粒细胞摄取和微环境响应性药物释放，体内实验证实该策略可有效加速焦虑小鼠的骨折愈合。该研究发表于《Bioactive Materials》。
**主要技术方法**
该研究使用了多种关键技术方法。在动物模型层面，采用7周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，通过14天慢性束缚应激（CRS）建立焦虑模型，并建立股骨闭合性横断骨折合并髓内固定模型。在细胞分析层面，运用密度梯度离心和磁激活细胞分选（MACS）分离骨髓中性粒细胞，流式细胞术鉴定TGFβ1?CCR5?亚群。机制研究采用转录组测序、KEGG通路富集分析、分子对接、药物亲和响应靶点稳定性分析（DARTS）、生物素拉下实验、细胞热位移分析（CETSA）、Western blot、免疫荧光和qRT-PCR。材料学表征采用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、X射线光电子能谱（XPS）、拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）。体内药效评估采用micro-CT、X射线、HE染色和Masson三色染色。
**研究结果**
**CRS损害骨折愈合并扩增TGFβ1?CCR5?中性粒细胞**
CRS小鼠在骨折后第21天仍保持清晰骨折线，骨痂形成极少，BV/TV和骨密度（BMD）显著降低，成骨标志物Col1a1、Bglap、Runx2的mRNA和蛋白水平均明显下调。流式细胞术和免疫荧光证实CRS组骨髓及骨折部位TGFβ1?CCR5?双阳性中性粒细胞比例显著升高。
**TGFβ1?CCR5?中性粒细胞以比例依赖性方式直接抑制BMSCs成骨分化**
通过MACS富集TGFβ1?CCR5?双阳性中性粒细胞并与BMSCs进行Transwell共培养实验，以不同比例（1:4至4:1）混合双阳性和双阴性中性粒细胞。随着双阳性细胞比例升高，BMSCs的ALP活性、矿化结节形成以及成骨标志基因和蛋白表达呈梯度下降。体内过继移植实验证实，移植TGFβ1?CCR5?双阳性中性粒细胞的小鼠骨折愈合显著延迟。
**AKBA减少TGFβ1?CCR5?中性粒细胞亚群并挽救BMSCs成骨分化**
CCK-8和活/死染色确定AKBA工作浓度为10μM。AKBA处理后，中性粒细胞CCR5和TGFβ1荧光强度显著降低，双阳性细胞比例明显下降。AKBA预处理的中性粒细胞与BMSCs共培养后，成骨相关基因和蛋白表达显著上调，ALP活性和矿化结节形成明显增强。
**AKBA通过直接结合YAP1调控USP31-NF-κB-CCR5信号轴**
转录组测序显示AKBA显著下调CCR5转录，KEGG富集分析揭示NF-κB通路受抑制。分子对接显示AKBA与YAP1结合自由能为?7.8 kcal/mol。免疫荧光共定位、DARTS、生物素拉下实验和CETSA证实AKBA直接结合YAP1蛋白，且YAP1第89位精氨酸（R89）为关键结合位点。AKBA通过结合YAP1解除其对USP31的抑制，从而阻断NF-κB磷酸化和核转位，最终下调CCR5表达。
**YAP1–USP31–NF-κB–CCR5轴的功能必要性在Hoxb8和HL-60细胞中验证**
在Hoxb8细胞中，AKBA处理显著上调USP31转录并下调CCR5转录，而YAP1过表达或USP31沉默可逆转这些效应。在蛋白水平，AKBA增加USP31表达、抑制p-p65磷酸化并减少CCR5蛋白丰度，这些变化同样被YAP1过表达或USP31沉默消除。人HL-60细胞系中的实验得到一致结果，提示该调控轴的跨物种相关性。此外，研究还证实CRS通过激活TRAF3/NF-κB轴诱导BMSCs中CCL5表达，形成TGFβ1–TRAF3–NF-κB–CCL5正反馈炎症放大环路。
**中性粒细胞靶向EGCG包被纳米载体实现AKBA递送和释放**
研究构建了NIMP-R14适配体修饰的EGCG纳米载体系统（AKBA@E-N）。TEM显示球形形貌和完整EGCG包被层。骨折微环境pH降至6.69–6.89，低pH加速EGCG包被层降解释放AKBA。包封率83.5%±2.1%，载药量13.2%±0.4%。细胞摄取实验证实仅中性粒细胞能高效摄取该载体，BMSCs、巨噬细胞和内皮细胞无明显吞噬。药代动力学显示AKBA@E-N在骨折部位滞留增加、血清药物浓度降低。生物相容性评估确认其无溶血、无显著细胞毒性、主要器官无病理损伤。
**AKBA@E-N体内治疗效果验证**
在CRS诱导的焦虑骨折小鼠模型中，AKBA@E-N组第14天骨折线明显模糊，第21天接近完全愈合，BV/TV和BMD显著高于其他治疗组，组织学显示骨痂结构排列有序、新骨形成比例最高、骨成熟度最佳。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究发现的TGFβ1?CCR5?中性粒细胞介导的致病轴与既往报道的酪氨酸羟化酶阳性（TH?）中性粒细胞介导的应激性骨损伤通路在机制和功能上截然不同，二者构成平行、独立的调控分支。上游激活信号、细胞起源、下游效应环路和最终骨骼表型均存在核心差异。本研究首次证明YAP1是AKBA的直接靶点，将YAP1功能从经典增殖调控拓展至中性粒细胞炎症极化控制领域。EGCG纳米载体兼具微环境响应降解特性和天然多酚安全性优势，NIMP-R14适配体赋予中性粒细胞选择性识别能力。
研究结论：本研究首次证明焦虑通过扩增TGFβ1?CCR5?致病性中性粒细胞亚群延迟骨折愈合，并揭示AKBA通过靶向YAP1–USP31–NF-κB–CCR5轴清除该亚群。基于此机制框架，研究人员开发的NIMP-R14修饰EGCG纳米载体系统可主动富集中性粒细胞并响应骨折微环境释放AKBA，从而显著加速焦虑小鼠骨愈合。通过机制解析与靶向干预相结合，该策略为心理应激相关骨修复障碍提供了新的治疗途径。
