靶向NETs-线粒体功能障碍-焦亡轴的诊疗性肽-硒水凝胶用于慢性糖尿病创面修复

《Bioactive Materials》：Theranostic Peptide-Selenium Hydrogel Targeting NETs-Mitochondrial Dysfunction-Pyroptosis Axis for Chronic Diabetic Wound Repair

　　

研究人员识别出NETs-线粒体功能障碍-焦亡轴是糖尿病慢性创面血管生成受损的核心病理驱动因素。构建了一种pH响应性CAS@OG诊疗水凝胶，该水凝胶整合了硒肽纳米颗粒和荧光碳点。该水凝胶能够实现创面pH微环境的实时可视化监测和pH触发的按需药物释放。它通过强效清除活性氧(ROS)协同消除NETs，维持线粒体稳态并抑制内皮细胞焦亡。该水凝胶在体外和体内均可加速糖尿病创面闭合、肉芽组织重塑和成熟血管生成。

慢性糖尿病创面是糖尿病最常见且最严重的并发症之一，常导致难愈性溃疡、继发感染甚至截肢。其发病机制复杂，炎症诱导的血管内皮细胞损伤是创面愈合受损的重要原因。失调的炎症微环境促进中性粒细胞募集，通过释放促炎介质和挤出双链DNA形成中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)。过量的NETs蓄积可触发内皮细胞线粒体功能障碍，进而导致细胞焦亡——一种炎性程序性细胞死亡。焦亡不仅减少内皮细胞数量并损害其功能，还加剧局部炎症和氧化应激，形成病理正反馈循环，显著损害创面修复。同时，创面pH失调及相关微环境紊乱会加剧线粒体氧化应激并放大炎症级联。然而，NETs、线粒体功能障碍与内皮焦亡之间的交互作用在糖尿病创面中尚不清楚。目前传统NETs抑制剂脱氧核糖核酸酶I(DNase1)既不能阻断NETs持续形成，也无法调节复杂病理微环境；临床生物材料缺乏靶向能力，且无法监测创面状态。因此，亟需高效、精准、诊疗一体化的策略。硒基氧化还原稳态系统为应对这些挑战提供了有效方案，硒可增强硒蛋白活性、抑制氧化应激相关炎症，减少NETs异常形成并维持线粒体稳态。基于此，研究人员提出假说：NETs诱导血管内皮细胞线粒体功能障碍，进而激活焦亡通路，最终损害血管生成并延缓糖尿病创面愈合。为验证该假说，研究人员整合公共单细胞转录组分析（数据集GSE268834）及体内外实验进行系统探究，并构建了多功能pH响应性诊疗水凝胶CAS@OG。该研究为慢性糖尿病创面的精准治疗提供了理论框架和材料平台，论文发表在《Bioactive Materials》。

主要关键技术方法包括：使用公共单细胞转录组数据集GSE268834进行生物信息学分析；建立高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型及STZ+DNase1机制模型；体外采用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激人外周血中性粒细胞诱导NETs，并提取纯化作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；通过硒与组氨酸修饰的Andersonin-W1肽(His-AW-1)自组装制备AS颗粒，以水热法合成碳点(CDs)；利用氧化黄芪多糖(OAPS)与明胶(Gel)席夫碱交联构建CAS@OG水凝胶；运用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)等表征材料；结合流式细胞术、Western blot、酶联免疫吸附测定(ELISA)、乳酸脱氢酶(LDH)释放、迁移/增殖/管形成实验及抗菌实验评估体外功能；通过H&E染色、Masson三色染色、免疫组化、免疫荧光和转录组测序(RNA-seq)评估体内效果。

研究结果如下：

2.1 糖尿病创面中NETs、线粒体功能障碍和焦亡的协同异常：单细胞转录组分析显示，与正常创面相比，糖尿病创面细胞中NETs相关炎症、线粒体功能障碍和焦亡签名均升高，内皮细胞中这些损伤程序激活最强。体内实验中，DNase1清除NETs后，糖尿病小鼠创面愈合加速，线粒体超微结构损伤显著减轻，Caspase-1和N-GSDMD表达及IL-1β/IL-18水平均降低，证实NETs蓄积是驱动创面病理的关键上游事件。

2.2 内皮细胞中NETs-线粒体功能障碍-焦亡轴：体外NETs刺激HUVEC后，线粒体ROS增加、线粒体膜电位丧失，NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路激活，IL-1β/IL-18分泌和LDH泄漏增加，内皮管形成受损。DNase1和线粒体ROS清除剂Mito-TEMPO可逆转这些效应；siRNA敲低NLRP3或GSDMD同样减轻了NETs诱导的内皮损伤和血管功能抑制，证明NETs通过诱导线粒体功能障碍激活焦亡并损害血管生成。

2.3 AS颗粒和CDs的表征：AS颗粒呈球形，直径约1000 nm，具有零价硒(Se0)特征和肽-硒配位结构，并呈现浓度依赖的·OH、O₂^·?和H₂O₂清除活性。CDs具有激发依赖的荧光特性且荧光强度随pH变化。

2.4 pH响应性CAS@OG水凝胶的表征：水凝胶具有良好自愈合性、可注射性、组织粘附性和机械稳定性。CDs的荧光在pH 4至8之间可逆切换；CAS@OG在酸性条件下加速溶胀、降解和AS颗粒释放，实现酸性微环境触发的按需释药。

2.5 复合水凝胶的体外生物活性：CDs掺入不影响OG水凝胶的生物相容性。在NETs刺激下，CAS@OG显著降低HUVEC内ROS，减少PI阳性细胞比例，恢复细胞迁移和增殖能力，并对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠杆菌(E. coli)具有最强的抗菌活性，同时促进LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞向M2表型极化。

2.6 CAS@OG减轻NETs诱导的内皮细胞线粒体功能障碍：流式和荧光成像显示CAS@OG显著降低MitoSOX信号，恢复JC-1红色聚集体/绿色单体比值，TEM观察显示其有效改善线粒体肿胀、嵴破坏和空泡化，表明CAS@OG保护线粒体结构和功能。

2.7 CAS@OG抑制NETs诱导的内皮焦亡并恢复血管生成：Western blot和免疫荧光显示CAS@OG显著下调NLRP3、Caspase-1、GSDMD和N-GSDMD表达，减少IL-1β/IL-18分泌和LDH释放。管形成实验中，CAS@OG使血管网络密度恢复至接近对照水平，在联合高糖(HG)刺激下同样有效，说明其抑制焦亡并恢复内皮血管生成功能。

2.8 CAS@OG在体内加速糖尿病创面闭合：在STZ诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型中，CAS@OG显著加速创面闭合，减少早期炎性渗出。H&E染色显示再上皮化增强、炎性细胞浸润减少和肉芽组织排列改善；Masson染色显示胶原沉积增加、细胞外基质重塑更致密。创面pH荧光监测显示pH变化趋势与实测值一致，可提供早期原位反馈。

2.9 CAS@OG在体内抑制创面焦亡并促进成熟血管生成：免疫荧光双染显示CAS@OG显著减少创面组织中MPO和CitH3共定位，抑制NETs形成。免疫组化显示Caspase-1和N-GSDMD表达显著降低，ELISA证实IL-1β/IL-18水平下降。同时，CD31和α-SMA荧光强度增加，表明新生血管数量增多且更成熟。

2.10 转录组学分析证实CAS@OG重塑炎症-再生程序：RNA-seq显示CAS@OG组与对照组相比有397个基因上调和400个下调；GO富集分析显示差异基因主要涉及线粒体电子传递、氧化磷酸化、ROS相关过程、NETs形成和急性炎症反应。GSEA分析进一步表明，NETs形成、线粒体功能障碍和焦亡/炎性信号签名在对照组中富集，而CAS@OG处理后相对抑制。qPCR验证了Padi4、Mpo、Ndufs1、Nlrp3、Il1b和Il18等关键基因的下调。

讨论部分指出，尽管CAS@OG表现出良好的促愈合效果，但仍存在局限性：糖尿病创面微环境除NETs外还涉及高血糖、高级糖基化终末产物等复杂因素，本研究未完全表征其相互作用；CAS@OG的体内抗菌效果有待在感染创面模型中验证；GSDMD介导焦亡的上游调控机制仍需深入探索。未来研究将结合体外高糖和NETs联合刺激、建立细菌感染糖尿病创面模型、研究上游调控机制、开展全面生物安全评价、规模化灭菌及货架期稳定性评估，并进行大动物验证，以推进临床转化。

研究结论可概括为：本研究揭示了NETs-线粒体功能障碍-焦亡轴是糖尿病创面血管生成受损的关键病理机制，并构建了整合pH监测与靶向调控该轴的诊疗水凝胶CAS@OG。通过清除NETs、维持线粒体稳态、抑制内皮焦亡，CAS@OG加速了糖尿病创面愈合，为慢性创面的精准管理提供了有前景的诊疗平台，也为炎症驱动的组织再生多功能生物材料设计提供了新思路。