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分泌因子是细胞通讯的重要介质，肿瘤利用这些因子来控制其微环境并逃避免疫攻击。然而，由于可靠地分析癌细胞特异性分泌因子存在挑战，癌细胞如何重编程其分泌组尚不清楚。在此，研究人员应用基于点击化学的方法，选择性地分析了患者来源的结直肠癌（CRC）和健康结肠类器官的分
分泌因子是细胞通讯的重要介质，肿瘤利用这些因子来控制其微环境并逃避免疫攻击。然而，由于可靠地分析癌细胞特异性分泌因子存在挑战，癌细胞如何重编程其分泌组尚不清楚。在此，研究人员应用基于点击化学的方法，选择性地分析了患者来源的结直肠癌（CRC）和健康结肠类器官的分泌组。研究人员观察到，在恶性转化过程中，分泌组发生癌细胞内在重编程，且微卫星稳定型（MSS）与不稳定型（MSI）癌症之间呈现明显分离。随后，研究人员利用该分泌组学数据集鉴定标记免疫排斥型癌症的分泌因子，揭示NOTUM在四个独立数据集中均为T细胞浸润减少的标志物。总体而言，该研究深入刻画了MSS-CRC的癌细胞内在分泌组，并提名NOTUM作为标记免疫排斥型结直肠癌的分泌因子。这为将癌细胞来源的分泌因子与相关肿瘤表型联系起来提供了一个可扩展的研究框架。
### 论文解读：结直肠癌分泌组的癌细胞内在重编程及其免疫排斥关联因子NOTUM的鉴定
#### 研究背景与问题
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤，其中约85%的患者为微卫星稳定型（microsatellite stable, MSS）肿瘤。MSS-CRC对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）普遍耐药，其机制涉及新抗原负荷低、肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）免疫抑制以及肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）稀少等。分泌因子是肿瘤细胞调控微环境、介导免疫逃逸的重要工具，但癌细胞如何相对于正常上皮细胞重塑其分泌组，以往并不清楚。传统研究面临多重障碍：常规肿瘤细胞系难以与健康细胞进行直接对照；对整体组织的蛋白质组学分析无法区分蛋白质来自癌细胞还是非恶性细胞；单细胞RNA测序虽能鉴定细胞来源，但mRNA丰度并不能准确反映蛋白质分泌水平；而常规分泌组学方法灵敏度有限，难以检测低丰度分泌蛋白。
#### 研究内容与结论
为克服上述限制，研究人员采用基于点击化学的代谢标记技术“苏氨酸衍生非天然氨基酸标签”（threonine-derived non-canonical amino acid tagging, THRONCAT），对患者来源的正常结肠（healthy colon, HC）和肿瘤类器官进行高分辨率分泌组分析。通过直接比较同一患者的正常与肿瘤类器官，研究人员揭示了MSS-CRC分泌组的广泛重编程，并发现MSS与微卫星不稳定型（microsatellite instable, MSI）CRC具有截然不同的分泌特征。进一步将分泌组数据与多个临床队列的转录组数据交叉分析，研究人员鉴定出NOTUM作为与T细胞浸润减少相关的分泌因子，并在四个独立数据集中得到验证。
#### 主要关键技术方法
研究人员利用THRONCAT方法，将非天然氨基酸类似物β-乙炔基丝氨酸（βES）加入完全培养基中培养类器官24小时，通过点击化学反应从培养基中富集新合成蛋白质，并经液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量。研究样本包括来自荷兰癌症研究所的患者来源类器官，涵盖2对配对HC与肿瘤类器官，以及7例MSS-CRC、6例MSI-CRC和3例HC类器官（见表1）。此外，研究还利用了TCGA（The Cancer Genome Atlas）和Hartwig Medical Foundation（HMF）的公开批量RNA测序数据，以及Pelka等人（2021）的单细胞RNA测序数据集，并对肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）的FFPE样本进行RNA测序分析。
#### 研究结果
**癌细胞内在重编程的CRC分泌组**
研究人员对2对配对HC和CRC类器官进行THRONCAT分析，经24小时标记后，主成分分析（PCA）显示HC与CRC类器官的分泌组可清晰分离。在过滤掉非分泌蛋白后，共鉴定到615个（患者1）和517个（患者2）蛋白，其中16%–25%的分泌蛋白发生显著改变。扩大队列后，共鉴定到559个分泌蛋白，差异表达分析发现83个蛋白在MSS-CRC类器官中显著上调，4个蛋白下调（FDR<0.1）。STRING蛋白互作网络分析显示，上调蛋白富集于细胞外基质（ECM）重塑（如TIMP1、TGFBI、CTSB、MMP2等）、血管生成（VEGFA、ANG等）、神经营养因子与轴突导向分子（SEMA3A、SERPINF1等），以及调控结肠干细胞龛的BMP、Wnt和受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路相关蛋白。此外，还观察到免疫调节相关因子改变，包括趋化因子信号、补体蛋白及其调节因子（C2、CFD、SRPX2）以及TNF超家族受体胞外域脱落释放。其中，Wnt信号负调控因子DKK4和NOTUM显著上调。
**MSS与MSI结直肠癌显示不同的分泌特征**
研究人员对7例MSS-CRC和6例MSI-CRC类器官进行分泌组比较，鉴定到457个分泌蛋白（过滤后）。无监督层次聚类和PCA均显示MSS与MSI类器官形成明显分离。将PCA第二主成分（PC2）的负贡献基因（富集于MSS）作为特征，在TCGA原发性和HMF转移性CRC的批量RNA测序数据中，该特征也能区分MSS与MSI肿瘤，验证了类器官中发现的亚型特异性分泌程序。差异表达分析确定NOTUM、FGF19、COCH和MFAP2为MSS-CRC类器官特有的关键分泌因子。ELISA验证了FGF19和NOTUM在MSS-CRC类器官中丰度更高，为质谱结果提供了正交验证。
**鉴定与免疫排斥CRC相关的分泌蛋白**
研究人员将MSS-CRC vs HC的分泌组数据与TCGA和HMF中T细胞浸润评分最高30%与最低30%的MSS-CRC肿瘤的差异基因表达分析结果相交集。通过分析，共鉴定出6个与低T细胞活性相关的分泌蛋白，其中NOTUM同时也是MSS-CRC vs MSI-CRC类器官中的显著高表达蛋白。在校正肿瘤纯度后，NOTUM在低T细胞浸润样本中仍显著过表达，表明该信号并非由免疫排斥肿瘤中上皮细胞比例升高所致的混杂效应。
**NOTUM是MSS-CRC特异性分泌蛋白，标记免疫排斥型癌症**
NOTUM在多项分析中均呈显著富集：在MSS-CRC vs HC分泌组中为最强上调蛋白之一；在MSS-CRC vs MSI-CRC分泌组中为差异最显著的蛋白之一；且在TCGA和HMF两个独立队列中均与T细胞浸润减少显著相关。在TCGA数据中，NOTUM在几乎所有原发MSS-CRC肿瘤中过表达，而在健康结直肠组织中表达极低。在Pelka等人（2021）的单细胞RNA测序数据集中，NOTUM在MSS-CRC的上皮细胞亚群中显著上调，且特异性表达于上皮细胞而非TME中的其他细胞类型。比较NOTUM高表达（上皮细胞中NOTUM阳性细胞比例前35%）与低表达（后35%）MSS-CRC肿瘤的免疫组成，NOTUM高表达肿瘤中CD4+ T细胞和NK细胞浸润显著降低。此外，在免疫排斥型肺腺癌和肺鳞癌队列中，NOTUM在免疫排斥型肿瘤中也显著上调，进一步支持NOTUM与免疫排斥的关联。然而，体外T细胞杀伤、反应性和迁移实验未观察到NOTUM的直接抑制作用，提示NOTUM可能作为标志物而非直接介导免疫排斥，或其在体内具有间接或环境依赖的免疫调节作用。
#### 讨论与结论总结
讨论部分指出，该研究通过整合患者来源类器官与THRONCAT技术，首次高分辨率定义了MSS-CRC的癌细胞内在分泌组，并证明恶性转化本身足以驱动分泌组的广泛重编程。MSS与MSI亚型在分泌组上的硬接线差异提示，分子亚型不仅体现于肿瘤微环境差异，也反映在癌细胞内在分泌程序上。通过将分泌组与多个临床队列整合，研究无偏地鉴定出NOTUM作为最突出的与T细胞排斥相关的癌细胞富集分泌蛋白，跨越四个独立数据集。NOTUM在几乎全部MSS-CRC肿瘤中过表达而健康组织低表达，且其药理学抑制在动物模型中已显示出抑瘤效果，使其成为有吸引力的治疗靶点。研究还展望了该方法在纵向采样研究治疗反应、比较原发与转移性肿瘤、区分肿瘤内在与外在调控因子等方面的应用潜力。
研究结论可翻译为：总之，研究人员展示了CRC分泌组与HC上皮如何内在地不同。研究人员在不受微环境影响的情况下定义分泌组，以理解恶性转化相关的细胞内在变化如何驱动分泌程序的重编程。这使得能够区分由癌细胞启动和驱动的分泌程序，而非对其环境的响应。研究人员预期，这为绘制感兴趣分泌因子的调控网络提供了框架，并为治疗靶向提供切入点。
