《Forests》：Comparative Genomic Analysis of Four Macadamia Species Reveals Lineage-Specific Gene Family Dynamics and Shared Whole-Genome Duplication
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澳洲坚果（Macadamia）是一种新兴的木本坚果，具有极高的经济价值。尽管目前已获得全部四个物种的基因组组装，但尚未开展整合分歧时间估算、谱系特异性基因家族动态和全基因组复制（whole-genome duplication, WGD）历史的综合性进化分析。
澳洲坚果（Macadamia）是一种新兴的木本坚果，具有极高的经济价值。尽管目前已获得全部四个物种的基因组组装，但尚未开展整合分歧时间估算、谱系特异性基因家族动态和全基因组复制（whole-genome duplication, WGD）历史的综合性进化分析。本研究对四种澳洲坚果（M. integrifolia、M. tetraphylla、M. jansenii和M. ternifolia）及其他11种植物进行了比较基因组分析。共鉴定出72,992个基因家族，其中物种特异性基因家族数量分别为：M. integrifolia 277个、M. tetraphylla 234个、M. ternifolia 236个、M. jansenii 183个。KEGG富集分析显示，M. integrifolia特有的基因富集于萜类生物合成和ABC转运蛋白通路，而其余三个物种的特有基因主要与苯丙烷类生物合成及氨基酸/碳水化合物代谢相关。系统发育分析显示，澳洲坚果属形成一个支持度良好的单系分支，其中M. integrifolia与M. tetraphylla构成一个亚支，M. ternifolia与M. jansenii构成另一个亚支。分歧时间估算表明，该属约在1030万年前（million years ago, Mya）发生分化，物种水平的分歧发生在7.8–8.4 Mya。基因组共线性分析揭示了保守的基因组结构，57.36%–59.68%的基因在物种间共线性区块中共享。基因家族动态分析揭示了萜类生物合成途径中的谱系富集模式：M. integrifolia中该途径扩张，而其他三个物种中收缩。WGD分析检测到两次WGD事件。在相对的Ks标度上，较近期的WGD事件与物种水平分歧重叠，而较古老的WGD事件由该属的共同祖先共享。这些发现为理解澳洲坚果进化提供了全面的基因组基础，并可能促进育种和保护工作的开展。
**比较基因组学视角下的澳洲坚果属进化：谱系特异性基因家族动态与共享全基因组复制**
**研究背景与科学问题**
澳洲坚果属（*Macadamia*）隶属于山龙眼科（Proteaceae），是原产于澳大利亚东海岸的高经济价值木本坚果作物。该属包含四个物种：*M. integrifolia*、*M. tetraphylla*、*M. ternifolia*和*M. jansenii*，其中商业栽培品种主要来源于前两者及其杂交后代。尽管过去十年间，四个物种的核基因组和细胞器基因组组装已相继完成，但已有研究多集中于单一物种或特定基因组特征，尚未有整合分歧时间估算、谱系特异性基因家族动态和全基因组复制（whole-genome duplication, WGD）历史的系统性比较进化分析。此前，Sharma等人虽建立了比较基因组框架，但所采用的物种数量有限，且未对物种特异性基因进行功能富集分析，也未估算分歧时间或系统分析WGD事件。此外，核基因组与叶绿体系统发育的不一致凸显了利用近完整核基因组解析物种关系和进化历史的必要性。因此，本研究旨在利用近端粒到端粒（telomere-to-telomere, T2T）组装的四个澳洲坚果物种基因组，结合11个代表性植物物种，开展全面的比较基因组分析，以阐明该属的物种分化、基因家族动态和WGD历史，为育种和保护提供基因组基础。
**研究内容与主要结论**
研究人员以四种澳洲坚果（*M. integrifolia*、*M. tetraphylla*、*M. jansenii*、*M. ternifolia*）及11种其他代表植物（包括水稻、油棕、橄榄、花生、核桃、油菜、大豆、芝麻、向日葵、莲和澳洲山龙眼）为对象，进行了比较基因组分析。主要结论包括：四个澳洲坚果物种形成一个支持度100%的单系分支，其中*M. integrifolia*与*M. tetraphylla*聚为一个亚支，*M. ternifolia*与*M. jansenii*聚为另一亚支；属级分歧约发生在10.3百万年前（Mya），物种级分歧为7.8–8.4 Mya；基因组共线性分析显示物种间57.36%–59.68%的基因位于共线性区块中，表明基因组结构高度保守；基因家族动态分析发现*M. integrifolia*在萜类生物合成途径上呈现显著扩张，而其他三个物种主要表现为收缩；WGD分析检测到两次WGD事件，较近期事件（Ks≈0.023）与物种分化重叠，较古老事件（Ks≈0.32）由属共同祖先共享。这些发现为理解澳洲坚果进化提供了全面基因组框架，并具有促进育种与保护的意义。
**主要关键技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：利用OrthoFinder对15个物种的蛋白质序列进行基因家族聚类，并提取物种特异性基因家族进行KEGG富集分析；基于790个单拷贝直系同源基因，采用MAFFT比对、Gblocks过滤、IQ-TREE构建最大似然系统发育树；利用PAML的MCMCTREE模块以四个化石校正点估算分歧时间；采用DIAMOND和MCScanX进行全基因组共线性分析；使用CAFE分析基因家族扩张与收缩，并以FDR校正的Q值<0.05为显著性阈值；采用wgd软件基于共线性旁系同源基因对的同义替换率（Ks）分布推断WGD事件。样本来源方面，*M. integrifolia*采用研究人员先前组装的‘Nanya 116’近T2T基因组（PacBio HiFi和Hi-C），其他三个物种基因组来自Sharma等人，参考基因组来自公共数据库。
**研究结果**
**3.1 基因家族聚类与物种特异性基因家族**
基于15个物种共鉴定出72,992个基因家族，其中1993个为所有物种共有。四个澳洲坚果物种的特异性基因家族数量分别为*M. integrifolia* 277个、*M. tetraphylla* 234个、*M. ternifolia* 236个、*M. jansenii* 183个。KEGG富集显示，*M. integrifolia*特异性基因富集于二萜生物合成、ABC转运蛋白等功能；*M. tetraphylla*富集于氨酰-tRNA生物合成、苯丙烷生物合成等；*M. ternifolia*富集于单菌霉素生物合成、角质/木栓质/蜡质生物合成等；*M. jansenii*富集于苯丙烷生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等。总体上，物种特异性基因集中体现在次生代谢产物合成和氨基酸/碳水化合物代谢两大类。
**3.2 系统发育关系、分歧时间与基因组共线性**
基于790个单拷贝直系同源基因构建的最大似然树以100%支持率确认了四个澳洲坚果物种的单系性及亚支结构。分歧时间估算表明属级分化约10.3 Mya，*M. integrifolia*与*M. tetraphylla*分歧约8.4 Mya，*M. jansenii*与*M. ternifolia*分歧约7.8 Mya，处于晚中新世。共线性分析显示，*M. integrifolia*与其他三个澳洲坚果物种的共线性基因比例（57.36%–59.68%）远高于与远缘物种的比例（3.02%–34.43%），印证了保守的基因组结构。
**3.3 基因家族扩张与收缩模式**
CAFE分析显示，所有15个物种中扩张基因家族数量普遍多于收缩。四个澳洲坚果物种中，*M. integrifolia*扩张基因家族最多（177个），收缩最少（24个）；*M. tetraphylla*、*M. ternifolia*、*M. jansenii*分别有103、92、80个扩张，65、61、68个收缩。KEGG富集显示各物种扩张基因家族的功能差异明显：*M. integrifolia*富集于萜类生物合成和ABC转运蛋白；*M. tetraphylla*富集于异喹啉生物碱和单萜生物合成；*M. ternifolia*富集于鞘脂代谢和萜类相关途径；*M. jansenii*富集于黄酮生物合成和昼夜节律。收缩基因家族同样涉及萜类途径。值得注意的是，萜类生物合成途径在四个物种的扩张和收缩基因集中均出现，表明该代谢网络经历复杂的进化动态，且*M. integrifolia*表现为最显著的萜类途径谱系富集扩张。
**3.4 全基因组复制事件**
基于MCScanX鉴定共线性旁系同源基因对并计算Ks值，四个澳洲坚果物种的种内Ks分布均呈现两个明显峰，分别位于Ks≈0.023和Ks≈0.32。第一个峰在种内和种间比较中均存在，被解释为较近期的WGD事件并与随后的物种分化重叠；第二个峰仅在种内比较中出现，被解释为属共同祖先经历的较古老WGD事件。与远缘物种（如核桃、油菜）的比较仅共享较古老峰，证明近期WGD事件为澳洲坚果谱系特有。两个峰之间约14倍的分离清晰表明两次独立的进化事件，且与系统发育关系一致。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，物种特异性基因家族的富集模式表明次生代谢和氨基酸/碳水化合物代谢是属内进化分化的关键靶标。*M. integrifolia*的萜类及ABC转运蛋白富集暗示其增强的萜类化学防御和转运能力；其他三个物种则主要涉及苯丙烷代谢，可能反映谱系特异的防御策略。系统发育结果与核基因组系统一致，尽管存在网状进化和基因树不一致的可能性，但多数据集的支持表明拓扑稳健。共线性与近期分歧说明属内尚未积累大量染色体重排。基因家族动态中，*M. integrifolia*扩张为主而其他物种扩张与收缩并存，表明萜类代谢的谱系差异进化。WGD分析确认了两次WGD事件，近期事件可能为属分化提供复制基因组材料，并与*M. integrifolia*萜类基因扩张相关。对育种而言，扩张基因家族（萜类、苯丙烷、脂肪酸代谢）为改良抗逆性、抗虫性和油质提供了候选靶基因，种间杂交可利用高共线性引入野生优良性状。对保护而言，各物种独特的防御相关代谢通路上调模式提示保护整个属可保留更广泛的遗传多样性，野生种群是栽培品种缺乏的遗传变异的重要储备库。
研究结论翻译如下：四种澳洲坚果物种的比较基因组分析为理解*Macadamia*的进化历史提供了基因组框架。四个物种亲缘关系密切、分化时间较近，并共享保守的基因组结构。萜类生物合成途径呈现谱系富集模式：*M. integrifolia*扩张最显著，其他三种物种则表现为更平衡或偏收缩的动态。四个物种共享两次WGD事件，其中较近的WGD事件在相对Ks标度上与物种分化重叠，较古老的WGD事件由共同祖先共享。这些发现增进了对澳洲坚果进化的理解，并可能促进这一新兴木本坚果的育种和保护工作，其野生种群正日益受到栖息地破碎化和气候变化的威胁。
