HSV-1 UL42与UL47劫持细胞核苷酸合成酶CAD促进裂解性复制：免疫逃逸与代谢重编程的耦合机制

《Journal of Virology》：HSV-1 UL42 and UL47 hijack cellular nucleotide synthetic enzyme CAD to promote lytic replication

　　

摘要专业翻译 细胞代谢酶在代谢中的作用已被充分阐明，但其超越代谢的功能仍知之甚少。本文报道，1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus 1，HSV-1）将炎症反应逃逸与代谢激活相耦联，以促进裂解性复制。具体而言，HSV-1激活氨甲酰磷酸合成酶-天冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酸酶（carbamoyl-phosphate synthetase, aspartate transcarbamoylase, and dihydroorotase，CAD），该酶催化嘧啶从头合成的限速步骤。被激活的CAD不仅为核苷酸从头合成提供原料，还能使RelA发生脱酰胺化（deamidation）。RelA脱酰胺化抑制NF-κB活化及炎症反应，同时上调关键糖酵解酶以促进有氧糖酵解。进一步的亲和纯化与功能实验鉴定出HSV-1的UL42和UL47蛋白可与CAD相互作用并激活CAD，重现RelA脱酰胺化的表型。综上，本研究揭示了代谢酶通过其蛋白脱酰胺酶活性，在HSV-1感染期间将免疫逃逸与代谢激活相耦联的新功能，为潜在治疗靶点提供了线索。

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一、研究背景与科学问题

宿主免疫防御与细胞代谢是决定病毒致病机制的两大基本生物学过程。1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus 1，HSV-1）是一种在人群中广泛存在的病原体，可在三叉神经节（trigeminal ganglia，TG）感觉神经元中建立潜伏感染，并在多种部位发生裂解性复制，导致唇疱疹、生殖器疱疹、疱疹性瘭疽及角膜炎等多种黏膜皮肤疾病，在少数感染者中还可引发严重脑炎。为在免疫健全的宿主体内持续存在，HSV-1进化出多种精细策略来操纵、逃逸并利用宿主免疫应答。例如，HSV-1的ICP27蛋白与TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）及干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）相互作用，阻碍干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）活化，从而减少干扰素（interferon，IFN）产生；被膜蛋白UL37可使维甲酸诱导基因I（retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I）和环状GMP-AMP合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）脱酰胺化以消除其活化及后续抗病毒免疫应答；ICP0作为E3连接酶以蛋白酶体依赖方式诱导多种宿主抗病毒因子降解。

与此同时，与其他病毒一样，HSV-1依赖宿主细胞机器完成其裂解性复制。为满足对能量和大分子的旺盛需求，HSV-1激活关键代谢酶以提供复制所需代谢物。已有报道表明HSV-1可激活糖酵解，并提升核苷酸生物合成尤其是嘧啶的从头合成水平。然而，HSV-1如何劫持宿主代谢通路来调控免疫应答，其分子机制此前尚不清楚。此外，UL42和UL47是HSV-1中调控病毒复制的关键因子：UL42作为必需的DNA聚合酶持续合成因子，直接结合催化亚基UL30充当滑动夹，确保病毒DNA高效合成而不发生过早解离，同时还能抑制I型干扰素产生和NF-κB活化；UL47（又称VP13/14）是丰富的结构被膜蛋白，在细胞核与细胞质之间动态穿梭，结合病毒RNA以调控基因表达，并促进衣壳包裹和病毒释放。蛋白脱酰胺化——将谷氨酰胺和天冬酰胺残基分别转化为谷氨酸和天冬氨酸的过程——最初被认为是自发反应并与蛋白质"衰老"相关，但近期研究表明，一小部分蛋白脱酰胺化可关键性调控蛋白功能，细菌效应蛋白及病毒和细胞脱酰胺酶均可通过靶向关键免疫信号分子来削弱宿主免疫防御。基于上述背景，研究人员提出核心科学问题：HSV-1如何通过劫持细胞代谢酶来耦联免疫逃逸与代谢激活，从而促进其裂解性复制？

二、研究内容与主要结论

研究人员通过代谢组学分析发现，HSV-1感染显著改变了宿主细胞代谢物整体格局，其中上调最显著的代谢物多为嘧啶类物质。利用同位素示踪实验证实HSV-1感染显著增强了CAD介导的嘧啶从头合成，并通过免疫印迹分析发现HSV-1感染使CAD第1859位丝氨酸（S1859）磷酸化水平提高4至6倍，表明HSV-1激活CAD以促进嘧啶从头合成。通过短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低和CRISPR/Cas9敲除实验证实CAD对HSV-1裂解性复制至关重要，且尿苷补充仅能部分恢复CAD缺失细胞中的病毒滴度，提示CAD促进HSV-1复制存在不依赖嘧啶合成的机制。进一步研究发现，HSV-1感染促进CAD介导的RelA脱酰胺化（N64/N139位点），从而抑制NF-κB依赖性炎症基因表达，同时上调糖酵解关键基因（如Hk1和Pfkl）表达并增强糖酵解通量。在RelA敲除小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中分别重建野生型RelA、脱酰胺化型RelA-DD（含N64D和N139D突变）及抗脱酰胺化型RelA-N64A，结果显示RelA-DD促进而RelA-N64A抑制HSV-1复制。通过亲和纯化结合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鉴定出7个与CAD结合的HSV-1蛋白（UL19、UL21、UL42、UL31、UL47、UL37和TK），其中UL42和UL47可激活CAD、促进RelA脱酰胺化、抑制NF-κB活性并增强嘧啶从头合成。综上，HSV-1通过UL42和UL47激活CAD，CAD不仅为核苷酸合成提供原料，还通过脱酰胺化RelA同时实现免疫逃逸和代谢重编程，从而促进病毒裂解性复制。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学分析及[酰胺-¹⁵N]谷氨酰胺和[U-¹³C]葡萄糖稳定同位素示踪实验，用于检测代谢物变化和代谢通量；短发夹RNA（shRNA）和CRISPR/Cas9基因编辑技术用于敲低或敲除CAD及构建RelA敲除MEFs的重建细胞系；二维凝胶电泳（2-DGE）结合免疫印迹用于检测RelA脱酰胺化；亲和纯化结合LC-MS/MS蛋白质组学用于鉴定CAD结合病毒蛋白；免疫共沉淀（co-IP）验证蛋白相互作用；双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB活性；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测炎症基因、糖酵解基因及病毒基因表达；病毒噬斑实验测定病毒滴度。细胞来源包括人胚肾293T（HEK293T）、非洲绿猴肾Vero、人包皮成纤维细胞（HFFs）、人结肠癌HCT116及小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。

四、研究结果

HSV-1激活CAD促进嘧啶从头合成。 通过LC-MS代谢组学分析发现，HSV-1感染HFFs后显著改变代谢物整体格局，上调最显著的代谢物以嘧啶类为主。利用[酰胺-¹⁵N]谷氨酰胺示踪实验证实，HSV-1感染MEFs和HFFs显著增加CAD直接产物二氢乳清酸（dihydroorotate，DHO）及其下游产物UMP和UTP的重同位素标记比例，表明CAD介导的嘧啶从头合成增强。免疫印迹分析显示HSV-1感染使CAD S1859磷酸化水平提高4至6倍，证实HSV-1激活CAD。

CAD以不依赖嘧啶合成的方式促进HSV-1裂解性复制。 shRNA敲低HFFs中CAD显著降低病毒蛋白表达，病毒滴度在感染后24小时降低4倍、48小时降低10倍。CRISPR/Cas9敲除MEFs中CAD使HSV-1滴度降低10倍以上。虽然尿苷补充可完全恢复CAD缺失MEFs的细胞增殖，但仅能部分恢复病毒滴度，证明CAD促进HSV-1复制存在独立于嘧啶生物合成的机制。

HSV-1促进CAD介导的RelA脱酰胺化以减弱炎症反应。 CAD敲低导致HSV-1感染HFFs中抗病毒炎症基因表达增加2至4倍。2-DGE分析显示HSV-1感染使RelA向凝胶条带正极端迁移，符合脱酰胺化结果；表达脱酰胺化型RelA-DD的细胞中HSV-1感染不再显著改变RelA迁移，证实HSV-1主要增加RelA N64和N139位点脱酰胺化。在RelA-KO MEFs重建实验中，RelA-DD使Ccl5、Cxcl2和Il8表达降低3至10倍，而RelA-N64A则增强Ccl5和Cxcl2表达，证明CAD介导的RelA脱酰胺化抑制HSV-1感染中的炎症基因表达。

HSV-1促进CAD介导的RelA脱酰胺化以上调糖酵解。 RelA-DD MEFs中糖酵解基因Hk1和Pfkl表达显著高于野生型MEFs，而RelA-N64A MEFs中其表达降低3倍。[U-¹³C]葡萄糖示踪实验显示，脱酰胺化RelA增加果糖-1,6-二磷酸（F-1,6-BP）、3-磷酸甘油酸（3PG）/2-磷酸甘油酸（2PG）和乳酸的标记比例；HSV-1感染增强野生型MEFs中糖酵解中间体的标记，但对RelA-DD细胞影响甚微，提示HSV-1感染期间可能需要动态而非静态完全的RelA脱酰胺化来驱动糖酵解。

CAD介导的RelA脱酰胺化促进HSV-1复制。 在重建MEFs中，RelA-DD使HSV-1滴度在24 hpi提高2.5倍、48 hpi提高8倍，而RelA-N64A使滴度在两个时间点均降低3倍以上。病毒基因表达分析显示RelA-DD增加而RelA-N64A降低病毒基因mRNA水平2至3倍，证实CAD介导的RelA脱酰胺化促进HSV-1裂解性复制。

HSV-1 UL42和UL47激活CAD。 亲和纯化结合LC-MS/MS鉴定出7个与CAD结合的HSV-1蛋白（UL19、UL21、UL42、UL31、UL47、UL37和TK），其中UL42、UL47和UL19显著降低NF-κB活性。2-DGE分析显示UL42和UL47而非UL19使RelA向正极端迁移，且对RelA-DD无进一步显著影响，表明UL42和UL47主要通过增加RelA N64和N139脱酰胺化发挥作用。[酰胺-¹⁵N]谷氨酰胺示踪实验显示UL42或UL47表达使DHO重同位素标记比例提高3倍，而UL19无此效应，证明UL42和UL47激活CAD。

五、讨论与结论

本研究揭示了代谢酶CAD在HSV-1感染中超越其经典代谢功能的非常规作用：HSV-1通过UL42和UL47激活CAD，激活的CAD不仅支持嘧啶从头合成，还通过其蛋白脱酰胺酶活性使RelA脱酰胺化，从而同时抑制NF-κB依赖性炎症应答并促进糖酵解基因表达，将免疫逃逸与代谢激活耦联以支持病毒裂解性复制。值得注意的是，SARS-CoV-2（RNA病毒）和HSV-1（DNA病毒）均利用CAD介导的RelA脱酰胺化来支持病毒复制，提示该通路在多种病毒感染中具有高度保守的作用模式。SARS-CoV-2的Nsp9蛋白作为桥梁诱导S6K1介导的CAD磷酸化，而HSV-1的UL42和UL47可直接激活CAD，尽管上游激活机制可能因病毒而异。被膜蛋白UL47在病毒侵入时即释放入胞质，而UL42在感染早期表达，二者构成序贯机制以在HSV-1感染的极早期和早期阶段持续激活CAD。CAD小分子抑制剂在SARS-CoV-2感染小鼠模型中已显示出强效抗病毒效果，其对HSV-1及其他DNA病毒的作用有待探索。靶向CAD的抑制剂有望成为广谱抗病毒策略，可单独使用或与靶向病毒的药物联合使用以克服病毒耐药性，且因CAD兼具脱酰胺酶及嘧啶合成之外的调控功能，可能较二氢乳清酸脱氢酶（dihydro-orotate dehydrogenase，DHODH）抑制剂具有额外优势。研究结论表明，HSV-1通过UL42和UL47劫持细胞核苷酸合成酶CAD，利用其脱酰胺酶活性将免疫逃逸与代谢重编程耦联，从而促进裂解性复制，CAD可作为潜在抗病毒治疗靶点。