鼻内共递送表达抗原性差异SARS-CoV-2 S蛋白的副流感病毒载体疫苗在仓鼠中诱导广泛且持久的免疫

《Journal of Virology》：Co-administration of intranasal parainfluenza virus vaccines expressing antigenically distinct SARS-CoV-2 S antigens elicits broad and durable immunity in hamsters

　　

摘要

能够在诱导广泛且持久的黏膜及系统性免疫方面发挥作用的鼻内COVID-19疫苗，作为独立疫苗或与注射疫苗联合使用均具有重要价值。研究人员在仓鼠模型中评估了共递送两种表达抗原性差异的预融合稳定化S蛋白（分别源自 ancestral SARS-CoV-2分离株的B/HPIV3/S-6P 与 BA.5/Omicron变异株的B/HPIV3/S-BA.5-2P）的减毒牛/人副流感病毒3型（bovine/human parainfluenza virus type 3，B/HPIV3）载体所诱导的免疫广度与保护持久性。上述载体正被开发为针对HPIV3和SARS-CoV-2的双价儿科疫苗，其以牛PIV3为骨架，并将其融合（fusion，F）蛋白和血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase，HN）糖蛋白替换为人PIV3的相应蛋白。为拓宽S特异性抗体应答，研究人员评估了上述表达S的B/HPIV3载体共递送策略。每种表达S的B/HPIV3载体均可诱导针对抗原匹配S蛋白的强效血清抗S IgG和IgA抗体水平，并至少维持5个月。共递送策略增加了S特异性抗体应答的广度，涵盖了每种载体单独诱导的应答范围。经鼻内免疫载体混合物的仓鼠产生了针对 ancestral 和近期流行的SARS-CoV-2毒株的中和抗体，并在免疫后5个月免受BA.5/Omicron攻毒，表现为无体重下降、无SARS-CoV-2攻毒病毒复制，且攻毒后气道中宿主炎症细胞因子无升高，表明保护作用具有持久性。因此，鼻内共递送表达抗原性差异S蛋白的减毒B/HPIV3载体可诱导广泛且持久的抗体应答，并提供针对BA.5/Omicron攻毒的长期保护。该策略值得进一步开发，并可能为应对新出现的SARS-CoV-2变异株提供更好的保护。

鼻内递送副流感病毒载体疫苗共表达抗原性差异SARS-CoV-2 S蛋白在仓鼠模型中诱导广泛且持久的免疫保护：研究解读

**一、研究背景与科学问题**

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的持续抗原演化使得新变异株不断出现并逃逸既有免疫。尽管以mRNA疫苗为代表的注射型SARS-CoV-2疫苗在降低COVID-19住院率和死亡率方面成效显著，但其在预防上呼吸道感染和病毒复制方面能力有限，且对阻断病毒传播的效果不佳。此外，mRNA疫苗或自然感染所诱导的免疫力在免疫后4至6个月内快速衰减。呼吸道黏膜免疫对于限制SARS-CoV-2复制及减少传播至关重要，因此亟需能够诱导广泛黏膜免疫和系统性免疫的鼻内递送活病毒载体疫苗。人副流感病毒3型（HPIV3）是婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体，而SARS-CoV-2对幼儿亦构成严重威胁。此前研究团队已开发出以减毒牛/人副流感病毒3型（B/HPIV3）为载体的鼻内疫苗平台，该载体以牛PIV3为骨架，其血凝素-神经氨酸酶（HN）和融合（F）蛋白替换为人PIV3的相应蛋白，既可作为HPIV3减毒活疫苗，又可作为外源抗原表达载体。研究人员曾构建表达 ancestral Wuhan-Hu-1株预融合稳定化S蛋白的B/HPIV3/S-6P候选疫苗，在仓鼠和恒河猴中证实其免疫原性和保护效力，并已进入Ⅰ期临床试验（Clinicaltrials.gov NCT06026514）。然而，既往研究显示，针对抗原匹配S抗原的免疫应答和保护效力优于针对抗原距离较远的变异株，提示单一S抗原疫苗的抗体广度有限。此外，既往仓鼠攻毒实验多在免疫后5周内进行，黏膜免疫保护的持久性尚待阐明。本研究旨在应对上述两大问题：一是通过共递送表达抗原性差异S蛋白的两种B/HPIV3载体来拓宽抗体应答广度；二是通过延长至免疫后5个月的攻毒实验来评估保护持久性。

**二、研究设计与技术方法**

研究人员采用金黄叙利亚仓鼠模型开展长期免疫-攻毒实验。仓鼠购自Envigo Laboratories（Frederick, MD），实验在经美国疾病控制与预防中心批准的BSL2和BSL3设施中进行。实验共设4组：空载体B/HPIV3对照组（n=18）、B/HPIV3/S-6P组（n=21）、B/HPIV3/S-BA.5-2P组（n=21）及两种载体混合物共递送组（n=21，各4.7 log₁₀ PFU，总剂量5 log₁₀ PFU）。主要关键技术方法包括：（1）反向遗传学技术：将密码子优化的BA.5/Omicron S开放阅读框（ORF）经“2P”双脯氨酸替换和furin酶切位点RRAR→GSAS突变改造后，插入B/HPIV3全长cDNA质粒N与P基因之间，经病毒拯救获得重组B/HPIV3/S-BA.5-2P；（2）双染色免疫蚀斑实验：用于定量载体病毒滴度及检测S抗原表达稳定性；（3）IgG/IgA双ELISA：以纯化的Wuhan-Hu-1 S-6P、RBD及BA.5 S-2P为包被抗原，检测血清特异性抗体滴度；（4）活病毒中和试验：在BSL3条件下检测血清对SARS-CoV-2 WA1/2020和BA.5/Omicron的中和抗体滴度（ND₅₀），并以表达eGFP的HPIV3进行PRNT₆₀中和试验；（5）ACE2结合抑制试验（Meso Scale Diagnostics V-PLEX SARS-CoV-2 Panel）评估抗体对不同变异株S蛋白的结合抑制广度；（6）TaqMan实时定量PCR：检测攻毒后鼻甲（NT）和肺组织中SARS-CoV-2亚基因组E（sgE）和N（sgN）mRNA水平，同时检测宿主炎症/抗病毒基因表达。

**三、主要研究结果**

**B/HPIV3/S-BA.5-2P的构建及体外特征**：研究人员构建了B/HPIV3/S-BA.5-2P重组病毒，该病毒在Vero细胞中有效表达未经切割的全长BA.5 S蛋白（S0），93.3%±2.5%的蚀斑呈S表达阳性，与B/HPIV3/S-6P（96.7%±1.7%）相当，表明S表达稳定。多轮复制动力学实验显示，两种S表达载体在Vero和A549细胞中复制动力学相似，峰值滴度较空载体低3至5倍。

**B/HPIV3/S表达载体在仓鼠体内的复制**：免疫后第3天和第5天，所有载体均在鼻甲和肺组织中有效复制。S表达载体在鼻甲中的滴度与空载体总体相当，但在肺组织中第5天滴度较空载体低4至25倍。双染色免疫蚀斑实验显示，鼻甲和肺组织中81%–92%和77%–91%的蚀斑表达S抗原，表明S表达在上下呼吸道中均具有良好稳定性。BA.5 S在仓鼠体内的表达稳定性略低于ancestral S，但差异较小。

**短期与长期血清SARS-CoV-2 S抗体应答**：免疫后第24天，B/HPIV3/S-6P诱导针对ancestral S和RBD的IgG/IgA显著高于B/HPIV3/S-BA.5-2P组，而B/HPIV3/S-BA.5-2P诱导针对BA.5 S的IgG显著高于前者。共递送组在针对两种S抗原的ELISA抗体水平上均优于对应的单载体组，且该抗体水平维持至第143天。中和试验显示，B/HPIV3/S-6P血清可中和WA1/2020但不可中和BA.5，B/HPIV3/S-BA.5-2P情况相反，而共递送组血清对两种毒株均具有强效中和活性（ND₅₀滴度1.3至2.1 log₁₀），且在5个月后进一步升高。ACE2结合抑制试验进一步表明，共递送组的血清抑制谱几乎覆盖了两种单载体组抑制谱的并集，对几乎所有检测变异株（Alpha至XBB）均表现出72%至100%的抑制率，仅对BA.1及其衍生株的抑制率较低（42%至72%）。

**免疫仓鼠对BA.5/Omicron攻毒的长期保护**：免疫后第150天（约5个月），以4.5 log₁₀ TCID₅₀/只的SARS-CoV-2 BA.5/Omicron进行鼻内攻毒。空载体对照组仓鼠出现轻度体重下降（中位下降1.6%），而三个S表达载体免疫组体重保持稳定或在第3至4天增加。炎症基因表达分析显示，空载体对照组在鼻甲和肺组织中均出现高水平的炎症/抗病毒基因表达（CCL2、CCL3、CCL5、IFIT3、IFN-L、IP-10、IRF7、MX2等），B/HPIV3/S-6P组在鼻甲中出现轻度炎症反应且个别动物肺部出现中度炎症，而B/HPIV3/S-BA.5-2P组和共递送组几乎无炎症反应。攻毒病毒复制方面，空载体对照组鼻甲和肺组织中病毒滴度分别达5.7和5.5 log₁₀ TCID₅₀/g，B/HPIV3/S-6P组鼻甲中病毒滴度约降低400倍，而B/HPIV3/S-BA.5-2P组和共递送组鼻甲中未检出攻毒病毒，所有S表达载体免疫组肺组织均未检出活病毒。亚基因组mRNA定量显示，共递送组和B/HPIV3/S-BA.5-2P组鼻甲中sgN mRNA较对照组降低约500倍，肺组织中未检出sgE或sgN mRNA。

**四、讨论与结论**

本研究表明，单次鼻内共递送表达ancestral S（B/HPIV3/S-6P）和BA.5/Omicron S（B/HPIV3/S-BA.5-2P）的两种减毒B/HPIV3载体，可在仓鼠中诱导广泛且持久至少5个月的血清抗体应答，其抗体广度涵盖两种单载体各自诱导的应答谱，提示两种载体间无明显干扰。免疫后5个月，共递送组和疫苗匹配的B/HPIV3/S-BA.5-2P组均对BA.5/Omicron攻毒具有强效保护，表现为无体重下降、无气道炎症反应，且上下呼吸道中未检出攻毒病毒复制。B/HPIV3/S-6P单独免疫对BA.5攻毒仅提供部分交叉保护，进一步证实了ancestral S抗原诱导的抗体对BA.5变异株的交叉中和能力有限。该研究首次在仓鼠模型中证实B/HPIV3载体鼻内疫苗的保护效力可维持至少5个月，且共递送策略可有效拓宽针对持续演化的SARS-CoV-2变异株的抗体广度。这一黏膜免疫策略值得进一步开展临床评估，以期为尤其是儿童等特殊人群提供针对HPIV3和COVID-19的广谱、持久保护。