圣路易斯脑炎病毒再出现株在脊椎动物与蚊虫细胞、库蚊及小鼠中的适应性比较研究

《Journal of Virology》：Comparative fitness of reemerging St. Louis encephalitis virus in vertebrate and mosquito cells, Culex tarsalis and Culex quinquefasciatus mosquitoes, and mice

　　

人类致病性黄病毒（orthoflavivirus）圣路易斯脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）在缺席十余年后，于2015年在美国西部重新出现，此后在加利福尼亚州持续扩展并保持跨年际传播。这一转变与2003年前SLEV活动历史上零星分布的模式不同，引发了一个问题：当代毒株是否在适应性（fitness）上优于早期毒株。为评估再出现的SLEV是否具有增强的感染性或传播性，研究人员将来自加利福尼亚州的5株当代基因III型（genotype III）毒株（2016–2023年）与2003年的一株历史基因V型（genotype V）毒株进行了比较。在哺乳动物、鸭和蚊虫细胞中评估了生长动力学（growth kinetics）；在实验室品系的环跗库蚊（Culex tarsalis）和致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）中评估了媒介能力（vector competence）；并在协作杂交重组互交小鼠（collaborative cross recombinant intercross mice）中测量了血液中的SLEV RNA水平。部分基因III型毒株在禽类细胞中产生的滴度高于历史基因V型毒株，但在哺乳动物或蚊虫细胞中无此差异。在两种蚊虫物种中，若干基因III型毒株感染和传播SLEV RNA的效率均高于历史毒株，但未观察到适应性的时间趋势。SLEV在致倦库蚊中的适应性等于或高于环跗库蚊。测序未发现与媒介感染表型相关的共有氨基酸替换。尽管基因III型毒株的峰值出现时间较历史毒株延迟，但小鼠血液中的SLEV RNA水平在各毒株间相当。这些发现表明，部分当代毒株表现出与历史毒株相当或更高的适应性，这可能有助于SLEV在加利福尼亚州的持续存在和传播，凸显了持续监测和针对性媒介控制的必要性。

一、研究背景与问题

圣路易斯脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Orthoflavivirus louisense），在美洲以鸟类与蚊虫之间的地方性动物病循环（enzootic cycle）方式传播，并可溢出感染人类，引起发热性疾病甚至脑炎。SLEV自20世纪30年代起在美国造成周期性暴发，并在20世纪70年代成为脑炎的主要病因之一，加利福尼亚州从20世纪40年代至90年代均有相关疫情。由于目前尚无针对SLEV的特异性治疗或疫苗，蚊虫控制仍是限制SLEV传播的主要公共卫生手段。

在加利福尼亚州，公共卫生机构通过人间病例、哨兵鸡血清转化、蚊虫监测以及媒介蚊虫的分布和丰度来监测SLEV活动。蚊虫监测显示，从1970年至2003年SLEV几乎每年都有活动，而2003年正是相关黄病毒西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）入侵该州的年份。自2004年至2015年，SLEV在加利福尼亚州蚊虫中未被检出。SLEV消失的原因尚未完全阐明，但WNV的交叉保护性免疫以及共享禽类储存宿主中高水平的WNV群体免疫可能抑制了SLEV的活动。2015年，SLEV在亚利桑那州凤凰城暴发，同年SLEV再次在加利福尼亚州被检出，并从南加州向北扩展至中央谷地及更北地区，2016年至2025年间已扩散至加利福尼亚州58个县中的22个县。2015年以来，SLEV阳性蚊虫池包括环跗库蚊（Culex tarsalis）、致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）等物种，其中2015年至2025年间95%的SLEV阳性蚊虫池为环跗库蚊或致倦库蚊。

SLEV自2015年重新引入后的年际持续存在和地理扩散引发了一个问题：其重新建立是否由适应性增强所介导。此前的基因组分析表明，2015年至2018年间美国西部的SLEV毒株与2005年阿根廷暴发相关的SLEV以及2014年阿根廷蚊虫分离株关系最为密切，支持南美引入的假说。2014年至2018年间在加利福尼亚州和美国西部流行的SLEV形成至少四个地理上不同的簇（a–d），均属于基因III型。尽管有这些遗传学见解，但尚无表型研究在细胞、蚊虫媒介或小鼠中表征再出现的基因III型SLEV的感染或传播动态，也未将2015年后的毒株与2004年前在加利福尼亚州流行的SLEV（如2003年毒株，属于基因V型）进行比较。因此，本研究旨在比较再出现的2015年后基因III型SLEV与2003年前基因V型SLEV的相对适应性，其中基因V型是SLEV在蚊虫中11年缺席之前在加利福尼亚州检出的最后一种基因型。

二、研究内容与结论

研究人员比较了2003年的一株历史基因V型SLEV毒株与2016年至2023年间从加利福尼亚州分离的五株基因III型SLEV毒株的适应性。适应性定义为在哺乳动物、鸭和蚊虫细胞中的感染性、小鼠中的病毒血症，以及在加利福尼亚州两种主要媒介蚊虫物种环跗库蚊和致倦库蚊两个品系中的感染性和传播性。研究发现，部分基因III型毒株在鸭胚成纤维细胞中产生的滴度高于历史基因V型毒株，但在哺乳动物或蚊虫细胞中无此差异。在两种蚊虫物种中，若干基因III型毒株感染和传播SLEV RNA的效率均高于历史毒株，但未观察到适应性的时间趋势。SLEV在致倦库蚊中的适应性等于或高于环跗库蚊。测序未发现与媒介感染表型相关的共有氨基酸替换。尽管基因III型毒株的峰值出现时间较历史毒株延迟，但小鼠血液中的SLEV RNA水平在各毒株间相当。这些发现表明，部分当代毒株表现出与历史毒株相当或更高的适应性，这可能有助于SLEV在加利福尼亚州的持续存在和传播，凸显了持续监测和针对性媒介控制的必要性。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：在非洲绿猴肾细胞（Vero）、鸭胚成纤维细胞（DEF）和环跗库蚊细胞（CxTr）中进行了多步生长曲线实验，以评估病毒复制动力学；使用实验室品系的环跗库蚊和致倦库蚊进行了媒介能力实验，通过人工膜饲喂含不同滴度SLEV的血餐，在13至15天后解剖蚊虫，分别检测体、腿翅和唾液中SLEV RNA，计算感染率、扩散率和传播率；使用协作杂交重组互交小鼠（collaborative cross recombinant intercross，RIX 024×023品系）进行皮下接种感染实验，在1至4天采集血液，通过qRT-PCR定量血液中SLEV RNA水平；通过全基因组测序和氨基酸比对分析不同毒株间的遗传差异。毒株来源为加利福尼亚州多个蚊虫控制区的常规虫媒病毒监测中收集的SLEV阳性蚊虫池，经Vero细胞分离和少量传代后制备工作毒株。

四、研究结果

SLEV感染动力学（细胞实验）：在Vero细胞中，各毒株感染动力学相似，均在3天达到7–8 log₁₀ PFU/mL的峰值滴度，仅2017_IIIa毒株在1至3天产生显著更高的滴度。在DEF细胞中，所有基因III型毒株在3至5天产生的平均滴度均显著高于2003_V毒株，其中2016_IIId和2022_IIId的曲线下面积（AUC）显著更高。在CxTr细胞中，峰值滴度延迟至4或5天，2003_V的AUC显著高于2016_IIId、2017_IIIa和2022_IIId。这些结果表明，部分当代基因III型毒株在禽类DEF细胞中表现出比历史基因V型毒株更高的适应性，而在哺乳动物Vero细胞和环跗库蚊细胞中的感染差异不太明显。

蚊虫媒介中的剂量反应：在环跗库蚊中，3 log₁₀ PFU/mL血餐剂量下所有毒株感染率极低或为零；5和6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下感染、扩散和传播率均升高。在致倦库蚊中，5和6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下各指标也随剂量升高。回滴定确认实际血餐剂量与目标浓度偏差在±0.5 log₁₀ PFU/mL以内。

蚊虫媒介中的毒株比较：在环跗库蚊中，5 log₁₀ PFU/mL剂量下2003_V的感染率显著高于2023_IIIa，2022_IIId的感染率也显著高于2023_IIIa；6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下2016_IIId的感染率显著高于2003_V和2023_IIIa。扩散和传播率在各剂量下均无显著差异。在致倦库蚊中，5 log₁₀ PFU/mL剂量下2003_V未感染任何蚊虫，而所有基因III型毒株均产生感染；2017_IIIa的感染率和扩散率显著高于其他多数毒株，且仅2017_IIIa的传播率显著高于2003_V。6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下，2017_IIIa和2023_IIId感染了100%的蚊虫，感染率显著高于2003_V，扩散率也显著高于所有其他毒株。总体而言，基因III型毒株在两种媒介中均表现出较高且毒株特异性的适应性，但未观察到与检出年份相关的适应性递增趋势。

蚊虫组织中的SLEV RNA水平：平均RNA水平按体>腿翅>唾液的顺序递减。在环跗库蚊中，5 log₁₀ PFU/mL剂量下2016_IIId体的平均RNA水平显著高于2022_IIId和2023_IIIa；6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下各毒株间无显著差异。在致倦库蚊中，5 log₁₀ PFU/mL剂量下2016_IIId和2017_IIIa体的RNA水平显著高于2023_IIId；6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下2017_IIIa在体和腿翅中的RNA水平显著高于所有其他毒株。唾液中各毒株间均无显著差异。

唾液中的感染性SLEV检测：对随机选取的致倦库蚊唾液样本进行蚀斑检测，所有SLEV RNA水平高于1.5 log₁₀基因组/样本的唾液均形成蚀斑，证明致倦库蚊能够传播具有感染性的基因III型SLEV。

媒介物种比较：在5 log₁₀ PFU/mL剂量下，致倦库蚊对2003_V完全不敏感（0%），而环跗库蚊的感染、扩散和传播率分别为34%、15%和11%；对于三种基因III型毒株，两物种间各指标无显著差异。在6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下，致倦库蚊的感染率在多数毒株中等于或显著高于环跗库蚊，扩散和传播率也呈现相同模式。总体上，所测SLEV毒株在致倦库蚊中的适应性等于或高于环跗库蚊。

SLEV媒介适应性的遗传决定因素：在六个毒株共60个氨基酸差异中，38个为2003_V毒株独有。在致倦库蚊中感染模式高（2017_IIIa和2023_IIId）或低（2016_IIId、2022_IIId、2023_IIIa）的毒株之间未发现共有的氨基酸差异。

小鼠中的SLEV动力学：所有SLEV毒株在RIX 024×023小鼠中均未引起临床疾病，体重变化与模拟接种组相似。所有六个毒株均在1至4天产生可检出的血液SLEV RNA，峰值出现在2或3天。2003_V在2天达到峰值，而多数基因III型毒株在3天达到峰值。除3天时2022_IIId和2023_IIId的RNA水平显著高于2003_V外，各毒株间RNA水平总体相当。

五、讨论与结论

本研究表明，所评估的五株2015年后基因III型毒株中，若干毒株在鸭胚成纤维细胞和致倦库蚊中表现出与历史2003年基因V型毒株相当或更高的感染性，尤其是在5 log₁₀ PFU/mL血餐剂量下。致倦库蚊暴露于2003_V毒株的5 log₁₀ PFU/mL剂量时未发生感染，而每个基因III型毒株均产生可测量的感染，部分毒株还产生扩散和唾液中的SLEV RNA。这一差异提示，部分当代SLEV谱系可能比2003_V更适合在生态学相关的雀形目禽类储存宿主病毒血症水平下感染致倦库蚊。在致倦库蚊唾液中检测到具有感染性的基因III型SLEV，也证明该物种能够传播感染性病毒。鉴于致倦库蚊在南加州和加州中部城市地区数量丰富，且这些地区持续报告州内大部分蚊虫SLEV活动，该物种媒介能力的增强可能促进SLEV的持续和地理广泛传播。相比之下，环跗库蚊对SLEV表现出更异质和毒株特异性的反应，部分基因III型毒株在6.7 log₁₀ PFU/mL剂量下显示出比2003_V更高的感染、扩散和传播成功率，但未出现清晰的适应性层级或与基因型分类或检出年份相关的规律。

与蚊虫媒介数据相反，在协作杂交RIX 024×023小鼠中未观察到血液SLEV RNA水平的重大差异，提示所评估毒株在易感哺乳动物模型中无适应性差异。另一个重要结果是2015年后SLEV毒株中未观察到时间性适应性趋势，基因III型毒株间的适应性差异似乎是特异性的，与检出年份无关。高媒介适应性毒株间缺乏共有突变，提示不同毒株的媒介能力差异可能受各毒株独特突变的影响，或由病毒遗传差异以外的因素驱动。

研究存在若干局限性，包括使用单一或少数的细胞类型、实验室适应品系的蚊虫可能不代表野生种群、小鼠并非SLEV的扩增宿主、使用冷冻病毒可能低估感染性、唾液采集仅作为传播的替代指标、实验条件无法反映自然环境的温度和湿度变化等。

研究结果对理解SLEV在加利福尼亚州的生态学具有重要意义。部分基因III型毒株增强的感染致倦库蚊能力可能有助于解释为何SLEV传播集中在当地该物种丰富的地区，包括科切拉谷和中央谷地。除媒介能力增强外，储存宿主和媒介蚊虫的扩散或移动、环境变化、储存宿主种群结构变化、WNV免疫鸟类中交叉保护降低，以及随机再引入和建立事件等因素均可能促成SLEV的再出现。本研究为基因III型SLEV在美国西部的遗传多样化提供了表型背景，随着多个基因III型谱系的持续流行，明确遗传变异如何转化为病毒适应性差异，对于预测SLEV传播区域和人间疾病风险具有重要意义。