裂谷热病毒毒力因子NSs靶向ATF4和XBP1驱动的未折叠蛋白反应

《Journal of Virology》：Rift Valley fever virus virulence factor NSs targets ATF4- and XBP1-driven unfolded protein response

　　

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）是一种蚊媒虫媒病毒，可感染人类和家养反刍动物，对非洲和中东国家的公共卫生和经济产生重大影响。RVFV非结构蛋白NSs是主要的病毒毒力因子，具有多种对抗宿主抗病毒反应的功能。其功能之一是促进宿主转录因子IIH（transcription factor IIH, TFIIH）亚基的降解，从而阻断宿主转录。然而，该功能在RVFV生命周期中的生物学意义仍不清楚。研究人员使用RVFV株MP-12及其缺乏TFIIH降解功能的突变体（NSs-mut病毒）来鉴定NSs介导的转录抑制所靶向的宿主基因。研究人员发现，与未感染细胞相比，NSs-mut病毒而非MP-12上调了未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）靶基因。两种病毒均激活了所有三种内质网应激传感器，包括PERK和IRE1。然而，只有MP-12通过抑制其各自下游介质ATF4和XBP1的表达来抑制PERK和IRE1通路。ATF4的表达在转录水平受到抑制，而XBP1的表达在转录后水平受到抑制。ATF4缺失对病毒滴度和非噬斑形成颗粒的产生产生负面影响，导致病毒的颗粒/噬斑形成单位（particle-to-PFU）比率改变。研究人员还表明，PERK通路的激活在NSs-mut病毒感染的细胞中发挥促生存作用，提示PERK通路参与RVFV诱导的细胞毒性。总之，该研究表明RVFV NSs抑制三条UPR通路中的两条，并通过抑制PERK通路促进RVFV诱导的细胞毒性。

裂谷热病毒（RVFV）是一种蚊媒虫媒病毒，感染人类和家养反刍动物，在非洲和中东国家造成严重的公共卫生与经济负担。病毒非结构蛋白NSs是主要毒力因子，具有多种拮抗宿主抗病毒反应的功能，包括抑制I型干扰素转录、降解蛋白激酶R（PKR），以及通过促进转录因子IIH（TFIIH）亚基p62降解而抑制宿主转录。然而，NSs介导的宿主转录抑制在病毒生命周期中的生物学意义尚不明确，其靶向的宿主基因和通路也有待鉴定。为回答这一问题，研究人员使用RVFV减毒株MP-12及其在NSs上携带R16H和M250K突变、丧失p62降解功能（但仍保留PKR降解能力）的突变病毒（NSs-mut病毒），比较两者感染宿主细胞后的转录组和细胞反应。研究发现，尽管两种病毒均能激活内质网应激和三条UPR通路，但MP-12的NSs通过抑制转录因子ATF4和XBP1的表达，选择性阻断PERK和IRE1两条UPR分支；NSs介导的UPR抑制还促进了RVFV诱导的细胞毒性。该研究将NSs的转录抑制功能与UPR调控直接联系起来，为揭示RVFV致病机制提供了重要依据。

在研究过程中，研究人员使用Vero E6细胞（缺乏I型干扰素基因的非洲绿猴肾细胞系）进行感染和转录组分析；通过RNA-seq结合STAR比对、DESeq2差异表达分析和QIAGEN Ingenuity通路分析（IPA）鉴定差异表达基因及通路；利用蛋白质印迹检测IRE1、PERK、eIF2α磷酸化及ATF6裂解等UPR标志；采用RT-qPCR和RT-PCR检测mRNA表达水平及XBP1剪接状态；使用siRNA敲低ATF4、XBP1、PERK，并使用PERK抑制剂GSK2606414进行功能验证；通过蔗糖梯度超速离心纯化病毒粒子并结合噬斑试验分析病毒产生；同时测定H₂O₂水平和细胞ATP活力，评估活性氧水平与细胞存活。

研究结果部分如下：

**MP-12下调UPR靶基因的表达**：研究人员对MP-12或NSs-mut病毒感染的Vero E6细胞进行RNA-seq分析。与未感染细胞相比，NSs-mut病毒感染显著上调HSPA5、HERPUD1等UPR靶基因，而MP-12对这些基因的上调幅度较小。通路分析显示，在MP-12感染的细胞中，UPR是显著被抑制的通路之一，并且XBP1、HMOX1等UPR相关基因在MP-12感染细胞中的表达低于NSs-mut病毒感染细胞。这表明MP-12的NSs能够抑制UPR介导的基因表达。

**MP-12和NSs-mut病毒激活三种ER应激传感器，而只有MP-12抑制UPR介质的表达**：通过蛋白质印迹和RT-qPCR实验，研究人员发现两种病毒均能诱导IRE1磷酸化、PERK磷酸化、eIF2α磷酸化以及ATF6裂解，说明三条UPR传感器均被激活。但只有MP-12抑制了XBP1 mRNA的剪接，导致剪接型XBP1（sXBP1）蛋白不表达；同时MP-12还在转录水平抑制ATF4 mRNA的表达。由于MP-12的XBP1抑制发生在NSs介导的mRNA核输出抑制之前，XBP1剪接抑制并非由mRNA核输出受阻引起。GCN2激酶未被RVFV感染激活，排除了其对eIF2α磷酸化的贡献。

**ATF4缺失降低RVFV病毒粒子产生**：研究人员通过siRNA分别敲低ATF4和XBP1后感染病毒。结果显示，ATF4缺失显著减少细胞内病毒蛋白积累、病毒粒子产生（减少80%–95%）以及感染性病毒滴度（减少约50%–80%），并改变病毒的颗粒/噬斑形成单位（particle-to-PFU）比率；XBP1缺失对感染性病毒滴度无显著影响，但可降低病毒粒子产生。ATF4缺失同时降低细胞内和细胞外感染性病毒滴度，提示ATF4影响病毒装配过程。

**XBP1和ATF4调节感染细胞中多个UPR诱导基因的表达**：RT-qPCR分析表明，在NSs-mut病毒感染的细胞中，XBP1参与HSPA5、SYVN1、CEBPB等基因的上调，ATF4参与HMOX1基因的上调；在MP-12感染的细胞中，XBP1参与PPP1R15A和HMOX1的表达，ATF4则负调控CEBPB。DDIT3的表达不受XBP1或ATF4缺失影响，提示存在其他转录因子调控该基因。

**RVFV感染细胞中HO-1表达的分析**：蛋白质印迹显示，MP-12感染细胞中HO-1蛋白水平低于NSs-mut病毒感染细胞，但两种病毒诱导的H₂O₂水平相似，说明HO-1的表达水平不是感染细胞内活性氧水平的主要决定因素。

**PERK磷酸化在NSs-mut病毒感染中发挥促生存作用**：使用PERK抑制剂GSK2606414处理或siRNA敲低PERK后，NSs-mut病毒感染细胞的活力显著降低，病毒滴度也下降；而在毒胡萝卜素（TG）处理的细胞中，PERK抑制反而提高细胞活力。ATF4缺失不影响NSs-mut病毒感染细胞的活力，但会降低感染性病毒产生，提示PERK的促生存作用并非通过ATF4介导。

总结讨论部分：研究表明，MP-12的NSs通过抑制XBP1剪接和ATF4转录，选择性阻断IRE1和PERK两条UPR分支，但保留ATF6通路。XBP1剪接抑制的具体机制仍需进一步研究。ATF4对病毒粒子产生具有正向作用，NSs抑制ATF4可能减少非噬斑形成颗粒的产生，从而有利于病毒在宿主体内有效复制和传播。PERK激活在NSs-mut病毒感染中介导促生存信号，且该效应不依赖ATF4。研究结论可概括为：RVFV NSs通过抑制PERK通路促进RVFV诱导的细胞毒性，并抑制三条UPR通路中的两条（IRE1和PERK）；这一发现揭示了NSs介导的宿主转录抑制与UPR调控之间的分子联系，加深了对RVFV致病机制的理解。