褐飞虱C型凝集素NlCTL2介导对昆虫病原真菌金龟子绿僵菌的免疫防御机制研究

《Biological Control》：A C-type lectin NlCTL2 mediates immune defense against the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliae in brown planthopper

　　

褐飞虱（BPH）是威胁全球水稻生产的主要害虫，其防治仍依赖化学杀虫剂，而微生物杀虫剂的效力常受宿主免疫系统制约。C型凝集素（CTLs）是一类含碳水化合物识别结构域（CRD）的蛋白超家族，在昆虫先天免疫中发挥关键作用。研究人员克隆并鉴定了褐飞虱中的一个CTL编码基因NlCTL2，发现其在血淋巴中高表达，且受真菌感染显著上调。重组蛋白rNlCTL2能以Ca2+依赖性方式凝集真菌分生孢子。通过RNA干扰（RNAi）沉默NlCTL2后，褐飞虱存活率和繁殖力下降，抗菌肽（AMP）基因表达及酚氧化酶（PO）活性受抑制，同时体内金龟子绿僵菌（M. anisopliae）增殖加剧，对该真菌的敏感性显著升高。研究表明，NlCTL2兼具调控宿主发育和抗真菌免疫的双重功能，为结合RNAi与昆虫病原真菌（EPF）的褐飞虱综合防治提供了潜在靶点。

研究背景与目的

褐飞虱（brown planthopper, BPH, Nilaparvata lugens St?l）是威胁全球水稻生产的首要害虫，因其迁飞能力强、遗传变异快及抗药性进化迅速，目前防治仍依赖化学杀虫剂。然而，随着抗药性问题日益严峻，亟需开发非化学、环境友好的防控策略。微生物杀虫剂因特异性高、持效性强和环境相容性好而被广泛用于害虫生物防治，但昆虫拥有强大的先天免疫系统，可清除入侵病原体，从而降低微生物农药的杀虫效力。因此，鉴定昆虫免疫防御基因并阐明其抗微生物机制，对于开发基于微生物的褐飞虱防控方法至关重要。昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi, EPF）如金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）可通过附着和穿透昆虫体壁自然致死害虫，在褐飞虱生物防治中极具应用潜力。C型凝集素（C-type lectins, CTLs）是一类含碳水化合物识别结构域（carbohydrate-recognition domain, CRD）的蛋白超家族，在昆虫中广泛分布，既可作为上游模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别病原体，也可作为下游效应分子发挥杀菌活性。尽管已有研究在完全变态昆虫中揭示了CTLs的免疫功能，但在半翅目昆虫褐飞虱中，CTLs在宿主发育和抗真菌免疫中的作用尚不清楚。为此，研究人员克隆并鉴定了褐飞虱的一个CTL编码基因NlCTL2，旨在揭示其在宿主发育和抗真菌免疫中的功能，为基于昆虫病原真菌和RNA干扰（RNA interference, RNAi）的褐飞虱综合治理提供新的潜在基因靶点。

主要研究方法

研究人员采用基因克隆与序列分析、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）检测时空表达与微生物诱导表达谱、原核表达与镍离子亲和层析纯化获得重组蛋白rNlCTL2、体外微生物凝集实验、双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）注射进行RNAi、生存率与繁殖力测定、真菌抗性生物测定（包括显微观察和定量PCR检测真菌增殖）、以及抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）基因表达与酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活性测定等关键技术方法。

研究结果

3.1 NlCTL2的序列特征

NlCTL2开放阅读框（open reading frame, ORF）长654 bp，编码217个氨基酸，预测分子量24.70 kDa，等电点8.67。序列分析显示，NlCTL2含N端17个氨基酸的信号肽，属于分泌蛋白；SMART分析鉴定出一个典型的CRD，内含保守三肽基序QPD（Gln-Pro-Asp）和六个保守半胱氨酸残基（Cys^{71/75/109/114/190/198}）。预测到五个O-连接糖基化位点，无N-连接糖基化位点。序列比对表明NlCTL2与西花蓟马CTL同源性最高（92.08%），系统发育分析显示其与半翅目CTL-S同源物聚为一支。

3.2 NlCTL2的时空表达与微生物诱导表达模式

qRT-PCR结果显示，NlCTL2在褐飞虱所有发育阶段均有表达，在新羽化雄成虫中表达量最高。组织特异性分析表明，雌雄成虫肠道和血淋巴中的表达量显著高于脂肪体和生殖组织。微生物诱导实验显示，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和金龟子绿僵菌均能诱导NlCTL2表达呈先升后降趋势；其中金龟子绿僵菌的诱导效果最为显著，注射后24 h表达量上升6.2倍，而大肠杆菌最大诱导倍数仅为3.0倍。

3.3 rNlCTL2的微生物凝集活性

经原核表达和纯化获得重组蛋白rNlCTL2，SDS-PAGE显示单一条带约30 kDa。微生物凝集实验表明，在Ca²⁺存在条件下，rNlCTL2可凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌及金龟子绿僵菌分生孢子，其中对金黄色葡萄球菌的凝集作用最强；无Ca²⁺时无凝集现象，对照牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）无论有无Ca²⁺均不引起凝集。

3.4 NlCTL2敲低降低宿主存活率与繁殖力

注射dsNlCTL2后，5龄若虫中NlCTL2表达水平显著降低，RNAi效率在第3天达70%。沉默NlCTL2后，褐飞虱存活率明显下降（第5天存活率74.2%，对照组90.8%）。雌成虫注射dsNlCTL2后，产卵量（平均114.0粒/雌）和卵孵化率（65.5%）均显著低于对照组（214.8粒/雌，93.6%）。卵巢解剖显示，NlCTL2沉默组雌虫卵巢较小，卵黄原蛋白（vitellogenin, NlVg）和卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, NlVgR）基因表达分别下降59.4%和43.3%。

3.5 NlCTL2敲低削弱了对金龟子绿僵菌的抗性

生物测定结果表明，沉默NlCTL2显著增加了褐飞虱若虫和成虫对金龟子绿僵菌的易感性。dsNlCTL2注射组5龄若虫、雌成虫和雄成虫在真菌感染后第3天的校正死亡率分别为47.5%、46.7%和49.2%，显著高于dsGFP对照组的35.8%、29.2%和35.0%。dsNlCTL2处理组的半数致死时间（median lethal time, LT₅₀）约为3.0天，较对照组的5.5天缩短了46.4%。

3.6 NlCTL2敲低促进金龟子绿僵菌在褐飞虱血腔中的增殖

显微观察和定量PCR分析显示，dsNlCTL2处理组褐飞虱血淋巴中金龟子绿僵菌菌丝体的数量显著高于对照组，qPCR检测表明真菌丰度为对照组的1.6倍。

3.7 NlCTL2敲低抑制免疫防御反应

沉默NlCTL2显著抑制了四种AMP基因（NldefA、NldefB、NllugA和NllugB）的表达，在处理后第3天，这些基因的表达水平较对照组分别下降了58.8%、64.7%、80.0%和54.2%。同时，NlCTL2沉默组褐飞虱的PO活性也显著低于对照组。

讨论与结论

讨论部分指出，昆虫CTLs是一类多功能蛋白，在宿主发育和病原体抵抗中发挥调节作用。NlCTL2属于S型CTL，含信号肽和单一CRD，是一种分泌蛋白，可能在胞外空间作为PRR触发免疫防御。其CRD内的QPD基序暗示其具有广谱微生物结合活性。时空表达谱显示NlCTL2在成虫羽化期快速上调，且在血淋巴中表达最高，肠道也有显著表达，提示其参与病原体抵抗和肠道微生物稳态维持。体外凝集实验证实rNlCTL2能以钙依赖性方式凝集真菌分生孢子，凸显其在抗真菌免疫中的关键作用。RNAi实验表明，沉默NlCTL2导致若虫存活率和成虫繁殖力显著下降，这可能与卵巢发育受损及NlVg/NlVgR表达降低有关，进一步证实CTL编码基因是RNAi防治褐飞虱的理想靶点。此外，沉默NlCTL2显著抑制了AMP基因表达和PO活性，削弱了体液免疫和细胞免疫，导致真菌快速增殖和宿主抗真菌能力下降，揭示了NlCTL2在激活免疫应答中的重要作用，同时也表明昆虫病原真菌与RNAi联合使用具有协同增效的杀虫潜力。

研究结论部分翻译如下：综上所述，研究人员鉴定并表征了CTL-S基因NlCTL2，该基因在褐飞虱肠道和血淋巴中高表达，并受金龟子绿僵菌感染强烈诱导。NlCTL2能以Ca²⁺依赖性方式凝集细菌细胞和真菌分生孢子。通过RNAi沉默NlCTL2导致褐飞虱存活率和繁殖力显著下降，并显著增加对真菌感染的敏感性。这些结果表明，NlCTL2在调控宿主发育和抗真菌免疫方面具有双重功能，突出了其作为通过RNAi与昆虫病原真菌联合应用的褐飞虱综合管理靶点的潜力。