《Journal of Virology》：Generation and characterization of a PRRSV-2 DIVA marker virus by deletion of a novel epitope in the nucleocapsid protein
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染给全球养猪业造成巨大的经济损失。目前，市场上尚无用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的DIVA（区分感染与接种疫苗动
猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染给全球养猪业造成巨大的经济损失。目前，市场上尚无用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的DIVA（区分感染与接种疫苗动物）疫苗。在本研究中，研究人员利用基于荧光的单B细胞抗体技术成功制备了一株针对PRRSV核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白的猪源单克隆抗体（C8）。C8单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）识别2型PRRSV N蛋白C末端的一个新型线性表位（92LSDSGRISYTVE103）。研究人员利用C8 mAb建立了一种竞争性酶联免疫吸附试验（competitive enzyme-linked immunosorbent assay，cELISA），用于检测针对该表位的PRRSV N蛋白抗体。此外，研究人员还成功拯救了一株PRRSV突变病毒rGSWW15/N?93。体外和体内试验表明，该突变病毒能够有效复制，并可诱导针对PRRSV的特异性抗体反应（通过商业化ELISA检测），但针对特异性表位（92LSDSGRISYTVE103）的抗体无法被所建立的cELISA检出。研究结果表明，该重组病毒与cELISA诊断方法联用，能够实现接种标记病毒动物与感染野生型病毒动物的血清学区分。本研究证明了通过靶向修饰N蛋白表位开发PRRSV DIVA疫苗的可行性，为促进PRRS防控提供了潜在策略。
**重要性**：开发PRRSV DIVA疫苗对于有效控制猪群中PRRS疫情至关重要。DIVA疫苗能够区分接种疫苗的动物和自然感染的动物，有助于疾病监测。在本研究中，研究人员鉴定了2型PRRSV N蛋白上的一个新型线性表位（92LSDSGRISYTVE103），并开发了靶向该表位的猪源单克隆抗体C8。随后建立了一种竞争性ELISA（cELISA），用于检测针对C8表位的PRRSV N蛋白特异性抗体。此外，研究人员成功构建了一株表位缺失突变病毒rGSWW15/N?93。虽然体内评估通过商业化ELISA确认了特异性抗体反应，但这些抗体无法识别所建cELISA中C8特异性表位。这些发现表明，将重组病毒与cELISA诊断检测相结合，能够准确区分接种疫苗的动物和感染野生型病毒的动物。
## 论文解读文章
### 研究背景与目的
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是影响全球现代养猪业最具经济负担的猪病之一，可导致母猪繁殖障碍及各年龄段猪只的呼吸道综合征。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为有囊膜、正义单链RNA病毒，归属于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）。国际病毒分类委员会（ICTV）将其分为两个独立种：PRRSV-1（Betaarterivirus europensis）和PRRSV-2（Betaarterivirus americense）。PRRSV基因组长约15 kb，包含至少11个开放阅读框（ORF），编码16种非结构蛋白和8种结构蛋白（GP2a、GP2b[E]、GP3、GP4、GP5a、GP5、M及N蛋白）。目前，疫苗接种是控制PRRS最有效的手段之一，但经改良活疫苗免疫的猪只与自然感染猪在血清学上无法区分。因此，开发能够区分感染与接种动物的DIVA（differentiating infected from vaccinated animals）标记疫苗，对于PRRS的控制与净化具有重要意义。理想的标记应具备两个基本特征：（i）候选标记应具有免疫优势，能够被多数野生型病毒感染群体识别；（ii）从疫苗病毒基因组中删除该标记不影响疫苗的存活力和免疫原性。PRRSV N蛋白是病毒最丰富的蛋白，具有高度免疫原性且氨基酸序列相对保守，感染后7–9天即可诱导产生非中和性抗体。由于商品化ELISA多采用重组N蛋白作为抗原，N蛋白上保守的免疫优势表位可被视为DIVA疫苗的候选标记。然而，目前尚无商业化的PRRS DIVA疫苗，本研究旨在通过单B细胞抗体技术鉴定N蛋白上的新型表位，并构建相应的表位缺失标记病毒，以探索PRRSV-2 DIVA疫苗的可行性。
### 研究内容与结论
研究人员首先通过序贯异源感染策略筛选最佳猪只供体，发现九寨沟猪0922#对GSWW/2015株具有高水平中和抗体。随后利用荧光激活细胞分选（FACS）从该猪外周血单个核细胞（PBMC）中分选PRRSV特异性B细胞，经单细胞PCR扩增和克隆，获得18对免疫球蛋白（Ig）重链和轻链基因，并在CHO-S细胞中表达为完整猪源IgG格式的单克隆抗体（mAb）。经免疫荧光试验（IFA）和Western blot验证，其中9株mAb（C4、C6、C8、C12、D6、D7、D8、D11和E1）均识别PRRSV N蛋白。利用肽ELISA和GST融合蛋白截短/突变分析，鉴定出C8 mAb识别2型PRRSV N蛋白C末端的新型线性表位92LSDSGRISYTVE103，其中第93位丝氨酸（S93）为关键氨基酸。序列比对显示该表位在2型PRRSV中保守，但在1型PRRSV中不保守。基于C8 mAb建立了竞争性ELISA（cELISA），并对中国甘肃省不同养殖系统采集的1,169份临床猪血清进行检测，总体抗体阳性率为61.2%（716/1,169）。通过反向遗传操作，基于2型PRRSV毒株GSWW/2015的全长cDNA感染性克隆，成功构建并拯救了在N蛋白S93位点发生单氨基酸缺失的突变病毒rGSWW15/N?93。IFA结果表明该突变病毒与C8抗体无反应性。体外生长动力学显示，突变病毒复制速度略慢，达峰时间较野生型延迟约24小时，但峰值滴度与野生型无显著差异。体内实验显示，rGSWW15/N?93接种猪只能够产生PRRSV特异性抗体（由商品化ELISA检测），但不产生针对C8表位的抗体（由cELISA检测），且突变病毒在体内稳定存在并可在攻击后提供保护。该研究证明了通过靶向修饰N蛋白表位开发PRRSV DIVA疫苗的可行性。
### 关键实验技术方法
本研究涉及以下主要关键技术方法：（1）单B细胞抗体技术，依托荧光激活细胞分选、单细胞PCR扩增及哺乳动物细胞表达，获得猪源单克隆抗体；（2）基于合成肽和GST融合蛋白的抗原表位作图分析；（3）竞争性ELISA（cELISA）的建立与优化；（4）反向遗传学技术，通过构建全长cDNA感染性克隆及定点突变，拯救标记病毒；（5）病毒纯化（蔗糖密度梯度离心）、IFA、Western blot、生长动力学测定及动物攻毒保护试验等常规病毒学与免疫学方法。临床血清样本（n=1,169）来自中国甘肃省不同地区和养殖体系。
### 研究结果
**筛选适合B细胞分选的最佳猪供体**：对3头PRRSV阴性九寨沟猪和3头长白猪多次接种不同PRRSV毒株后，仅九寨沟猪0922#对GSWW/2015株表现出高中和抗体水平，故选用其PBMC用于后续单B细胞分选。
**PRRSV病毒颗粒纯化**：采用蔗糖密度梯度离心法纯化PRRSV病毒粒子，经负染后电镜观察，可见典型球形囊膜包裹的完整病毒颗粒，直径大多在50–80 nm范围，少数颗粒超过120 nm。
**利用单B细胞抗体技术筛选PRRSV特异性mAb**：FACS分析显示PRRSV特异性B细胞占猪PBMC的比例低于0.1%，经单细胞测序和表达，获得9株能够与PRRSV感染细胞反应并识别N蛋白的猪源mAb（C4、C6、C8、C12、D6、D7、D8、D11和E1）。
**鉴定N蛋白C末端的新型线性表位**：通过肽ELISA和GST融合蛋白截短/突变分析，确定C8 mAb识别的表位为92LSDSGRISYTVE103，S93为关键氨基酸；该表位为2型PRRSV特异性保守表位。
**cELISA检测临床血清样本中的PRRSV抗体**：基于C8 mAb建立cELISA，对甘肃省1,169份猪血清进行检测，总抗体阳性率为61.2%；其中接种疫苗猪场阳性率平均为80.1%，未接种疫苗猪场阳性率平均为69.5%，田间样品阳性率平均为15.6%。
**拯救缺失C8识别表位的PRRSV突变株**：通过单氨基酸缺失策略成功拯救rGSWW15/N?93病毒，该病毒保有复制能力且不与C8 mAb反应；免疫小鼠实验证明cELISA能够区分N?93蛋白抗体与N93A94A蛋白抗体。
**rGSWW15/N?93的体内特征**：突变病毒感染猪只的PRRSV特异性抗体转阳时间为14–28 dpi，稍迟于野生型病毒组（14 dpi），但全程未产生针对C8表位的抗体；突变病毒组猪只临床症状较野生型组更轻；攻毒后所有组均未出现体温升高。定量PCR检测显示突变病毒组病毒载量在各时间点均低于野生型组。对7 dpi猪只全血进行ORF7测序确认缺失突变在体内稳定存在，未发生回复突变。
### 讨论与结论
标记疫苗对于控制和根除感染性家畜疾病至关重要。以往PRRSV DIVA疫苗研究主要聚焦于Nsp2区域，因其遗传变异度高且富含可操作表位；然而Nsp2的遗传不稳定性可能削弱标记的稳定性。N蛋白作为保守性较高的替代靶点更具吸引力。已报道的N蛋白抗原区域包括51–67、69–123、79–87、103–109和109–113位氨基酸区域。本研究鉴定得到的新型表位92LSDSGRISYTVE103的删除提供了一种新的PRRSV-2 DIVA标记开发途径。虽然rGSWW15/N?93较野生型毒株表现出略低的复制能力和病毒载量，但仍保留了相当的致病性。单氨基酸修饰不会造成明显减毒，未来研究需寻找额外突变以开发更安全有效的疫苗候选株。单B细胞抗体制备技术为快速分离抗原特异性mAb提供了有力工具，本工作以纯化的完整PRRSV病毒粒子为抗原，所获mAb可作为抗原表征研究和诊断方法开发的重要资源。C8 mAb为基础的cELISA能够特异地检测野生型感染动物中存在的N蛋白表位抗体，而接种标记病毒的动物不产生该抗体，使有效区分成为可能。
综上所述，rGSWW15/N?93体外和体内特征均表明，N蛋白第93位丝氨酸的缺失导致突变病毒生长动力学变慢，且接种猪只不产生针对该表位的抗体，而野生型病毒感染猪只则产生强阳性反应。本研究为PRRSV-2 N蛋白中免疫优势B细胞表位的缺失在开发DIVA标记病毒中的应用提供了有力证据，将表位缺失与配套cELISA相结合，为建立猪繁殖与呼吸综合征鉴别诊断策略开辟了新途径。
