脑肿瘤相互作用的三分模式超声成像

《iScience》：Trimodal ultrasound imaging of brain-tumor interaction

　　亮点
- 三模态超声成像技术可同时显示肿瘤、血管和脑功能
- 声学报告基因能够追踪清醒状态下的U87胶质母细胞瘤的生长
- 共注册技术将功能衰退与分子定义的肿瘤联系起来
- 在一次头部固定的实验中，每隔几分钟获取三种超声数据

摘要
脑肿瘤通过破坏脑组织并改变局部和整体的神经血管活动及血流，导致严重的神经功能障碍。在动物模型中研究肿瘤-脑相互作用具有挑战性，因为没有一种方法能够同时捕捉肿瘤生长、神经血管活动和血管重塑的过程。在这里，我们结合了非线性成像技术、功能性血流动力学成像和超分辨率血管显微镜，开发出了一个多模态超声平台来解决这一难题。将该平台应用于U87胶质母细胞瘤异种移植模型后，我们跟踪了各动物的整个疾病进程。三种数据的共注册将外侧膝状核的位移和功能衰退与分子定义的肿瘤及其周围的血管重塑联系起来。我们还发现了一种肿瘤内在的血流动力学信号，这种信号在空间上均匀分布且与周围网络无关，而单独的血流动力学成像难以将其与受压组织区分开来。这一平台为更具有侵袭性的胶质瘤模型的机制研究奠定了基础。

引言
脑肿瘤（如胶质瘤）与大脑中的原生细胞相互作用，可以重塑整个大脑的功能活动、血管结构和代谢过程。先前的研究表明，肿瘤附近和远端的神经和血流动力学活动模式都发生了显著变化。脑肿瘤还会通过促进新的渗漏性和功能障碍性血管的生长来重塑大脑血管结构，从而破坏血脑屏障、引起水肿并增加颅内压。此外，肿瘤细胞与神经元之间对代谢资源的竞争会加剧神经功能障碍和退化。这些破坏机制共同对大脑健康、功能和患者福祉产生深远影响。虽然已有几种成像技术用于脑肿瘤研究，但每种技术都存在关键局限性：磁共振成像（MRI）能够覆盖整个大脑，广泛用于追踪肿瘤生长和血管变化，但不支持在清醒状态下的研究；双光子光学方法能够以高分辨率显示细胞或血管动态，但仅限于大脑皮层表面；正电子发射断层扫描（PET）能够敏感地检测代谢变化，但空间和时间分辨率较低且存在辐射限制。更重要的是，目前没有一种技术能够在单次共注册的成像过程中同时捕捉肿瘤生长、血管重塑以及神经活动的血流动力学相关性。在独立的设备上获取这些数据需要进行独立的配准步骤，并且不同生理状态之间的关联容易被混淆，而我们的方法旨在解决这一问题。因此，我们开发了这种多平面三模态超声平台。

在这里，我们通过开发并实施一项概念验证研究来应对这一技术挑战，该平台能够在清醒状态下同时成像肿瘤、血管和神经血管活动。超声技术特别适合这项任务，因为它便携、无创，能够穿透不透明组织（深度达几厘米），并提供高空间分辨率（约100微米）。最近的进展进一步扩展了其在肿瘤生物学相关领域的应用能力。基于气体囊泡（GVs）的 acoustic reporter 基因（ARGs）使得可以通过超声直接可视化基因定义的肿瘤细胞，从而实现肿瘤生长的纵向追踪。功能性超声成像（fUSI）利用超快多普勒序列在清醒状态下的高空间时间分辨率下绘制整个大脑的神经血管活动图谱。尽管 fUSI 需依赖神经血管耦合，因此是神经元活动的间接指标，但已在健康大脑中得到广泛验证。同时记录结果表明，功率多普勒信号与神经电生理数据（如 Neuropixels 电极测量的局部放电率）密切相关，而双光子成像也证实了两者之间的紧密对应关系。这些验证结果支持 fUSI 作为生理条件下神经动态的可靠测量工具。最后，超声定位显微镜（ULM）通过追踪循环的微气泡（分辨率约10微米）来重建微血管网络，突破了衍射极限，揭示了肿瘤驱动的血管生成和重塑现象。综合这些互补技术，超声成为在单个动物中同时进行分子、血管和功能成像的独特多功能工具。在本研究中，我们结合了 ARGs、fUSI 和 ULM，形成了一个协同成像平台，用于研究脑肿瘤相互作用的分子、功能和结构动态。

我们通过创建一个稳定的 GV 表达 U87 胶质母细胞瘤细胞系、将其植入免疫缺陷小鼠体内，并分别在每只小鼠的整个疾病过程中映射肿瘤生长及其对神经血管感觉诱发活动和连接性以及血管重塑的影响，来展示该平台的能力。所有三种类型的数据都是在持续不到1小时的成像会话中获得的，并在整个肿瘤生长期内重复进行。这些实验表明，不同成像技术的结合揭示了肿瘤影响的多个方面：GVs 可以直接追踪肿瘤生长；fUSI 揭示了感觉诱发神经血管反应的逐步破坏和区域间连接性的重组；ULM 则暴露了局部血管紊乱和血管生成现象。重要的是，由于这些测量数据共享相同的坐标系，并且是在相同的生理状态下每隔几分钟获取的，我们可以超越单独分析每个指标的局限，将特定的功能变化归因于其分子和血管原因：视觉诱发的外侧膝状核（LGN）反应的位移和逐渐减弱可以与 GV 定义的肿瘤边界以及共定位的肿瘤周围血管紊乱相对应；而空间均匀、与网络无关的脑血容量（CBV）特征可以归因于肿瘤本身，而不是仅受压的神经组织，因为分子信号独立定义了肿瘤的范围。这些结论是单一技术或单独的注册数据集无法单独得出的。我们强调，本研究仅是一小群样本的方法验证，生物学推广需要更大规模的样本和额外的肿瘤模型。

结果
慢病毒递送气体囊泡基因能够在胶质母细胞瘤细胞中实现稳定的超声对比度
为了开发一个能够追踪肿瘤进展及其对神经血管回路影响的成像平台，我们改造了一个稳定的 U87 人类胶质母细胞瘤细胞系——这是一个广泛用于研究胶质母细胞瘤的成熟模型细胞系——使其表达 GVs。我们使用了两种预先建立的慢病毒载体来共同递送来自 Anabaena flos aquae 的 8 个 GV 编码基因（图 1A）。第一个载体包含 GV 蛋白 A（GvpA）、内部核糖体进入位点（IRES）和红色荧光蛋白（RFP），受四环素响应元件（TRE）和反向四环素控制的可逆激活因子（rtTA）的调控，从而在最小 EF1a 启动子控制下实现多西环素诱导的表达；第二个载体包含 GV 形成所需的所有基因（N, J, K, F, G, W, V）和绿色荧光蛋白（GFP），也受 TRE 的调控。RFP 和 GFP 这两种荧光标记物用于辅助基因工程。

图 1 工程化和验证表达 GVs 的 U87 胶质母细胞瘤细胞以进行超声成像
- （A）用于工程化表达 GVs 的 U87 胶质母细胞瘤细胞的遗传构建示意图。两种慢病毒用于递送编码 GV 表达的八个基因、一个 rtTA 可逆激活因子以及两个荧光标记物。
- （B）使用 annexin V 和 SYTOX Blue 进行的细胞活力检测。结果显示未诱导和多西环素诱导细胞的存活率没有显著差异，说明 GV 表达的诱导不影响细胞活力。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。
- （C）未诱导和多西环素诱导的 GV 表达 U87 细胞的超声成像。线性（B 模式）和非线性（AM）超声图像显示了 GV 表达带来的对比度增强。
- （D）使用野生型（WT）细胞作为噪声参考，计算未诱导和诱导细胞的超声信噪比（CNR），突出显示 GV 表达细胞的增强信号。比例尺为 1 毫米。

慢病毒转导后，荧光检测显示 27% 的细胞群体同时携带这两种病毒构建体（平均值 ± 标准误差（SEM））。这种阳性水平在三轮诱导过程中保持稳定（图 S1A 和 S1B）。通过 annexin V 和 SYTOX Blue 染色测量发现，诱导细胞与未诱导细胞在活力上没有显著差异（图 1B）。我们将细胞嵌入水凝胶 Phantom 中进行体外超声成像，并使用调幅调制（AM）方法进行成像，该方法优化用于检测 GV 的非线性声学响应。如图 1C 所示，诱导和未诱导样本的线性 B 模式信号相当，提供了基于组织回声性的常规超声图像，并作为背景细胞散射的基准测量。相比之下，诱导细胞的非线性 AM 信号显著增强，而未诱导对照组的信号几乎消失，这表明 GV 表达是产生非线性对比度的必要条件。定量分析显示，诱导细胞的非线性信号比对照组增加了约 20 分贝（图 1D）。这些实验确立了我们的 GV 表达 U87 细胞系作为一个可以通过超声可靠成像的模型胶质母细胞瘤细胞系，为后续的体内研究奠定了基础。

三模态超声成像揭示肿瘤生长、神经血管活动和血管重塑
在验证了我们的 GV 表达 U87 细胞系在体外产生强烈且特定的超声对比度后，我们接下来构建了一个体内模型，以便纵向监测肿瘤生长并直接将其与神经血管活动和血管重塑的变化联系起来。为此，我们将这些细胞植入 3 只非肥胖糖尿病（NOD）scid γ（NSG）小鼠的脑中，这一样本量被明确视为概念验证队列，以便在清醒状态下的动物中监测肿瘤生长及其相关的功能血流动力学和血管变化（图 2A 和 2B）。虽然可以通过完整的小鼠头骨进行超声成像，但为了提高图像质量和信号灵敏度，我们选择进行开颅手术，用 125 微米厚的聚甲基戊烯（PMP）窗口替换头骨，以减少声散射。为了进一步支持清醒状态下的高质量成像，我们还安装了头骨固定板，使小鼠能够在空气悬浮的 arena 中自由移动，从而减少焦虑并便于行为追踪。

图 2 使用三模态超声成像在小鼠脑内追踪 GV 表达的胶质母细胞瘤
- （A）实验装置示意图。超声探头位于动物头部上方，并固定在定制的头部固定框架上。动物保持清醒状态，可以在空气缓冲的平台上自由移动。
- （B）三模态成像的代表性体积渲染图，显示肿瘤定位、血管结构和功能激活。非线性超声成像检测 GV 表达的肿瘤细胞，ULM 显示详细的微血管结构，fUSI 捕捉视觉诱发的神经血管反应。
- （C）实验时间线。基线成像在 ?5 天和 ?3 天进行，随后在植入后第 0 天植入肿瘤细胞。在植入后的第 5 天、8 天和 11 天进行了两次成像。结果显示，随着时间的推移，GV 表达的肿瘤（热色）变得越来越明显，伴随周围微血管（灰色）和视觉诱发的激活模式（绿色）的变化。结果代表 3 只小鼠的数据。其他小鼠的数据见图 S3。
- （E）相应前后平面的冠状切片中的天然 RFP/GFP 荧光组织学；肿瘤范围与 (D) 中的体内非线性 AM 信号一致。

为了在相同动物中建立稳定的肿瘤前基线和纵向追踪肿瘤诱导的变化，每只小鼠接受了五次成像：两次植入前的基线成像和植入后第 5 天、8 天和 11 天的后续扫描（图 2C）。研究结束后提取所有大脑样本，以便将超声衍生的肿瘤信号与植入细胞的天然 RFP/GFP 荧光进行组织学验证（图 2E）。在每个时间点都进行了三模态成像。首先，我们利用非线性AM技术对肿瘤进行了可视化处理，这一技术利用了表达GV的肿瘤细胞的声学特征。其次，在视觉诱发的条件下，我们使用fUSI记录了神经血管活动。视觉刺激通过一个5赫兹闪烁的蓝色发光二极管（LED）传递，体素级的相关性分析显示了LGN的强烈血流动力学激活。最后，我们在静脉注射微泡后使用ULM捕捉到了大脑微血管的高分辨率图像。每只动物的扫描涵盖了五个冠状平面：小鼠1的冠状平面从前向后（AP）为β = ?1.7到?2.5毫米（0.2毫米递增），小鼠2的冠状平面为AP = ?2.2到?2.8毫米（四个冠状平面），小鼠3的冠状平面为AP = ?2.1到?2.9毫米（见图S2）。在基线阶段，我们通过匹配不同会话中的血管标志物来验证探针位置的可重复性。我们还确认了在两天基线日期间，两侧LGN对视觉刺激都有响应。完成这些验证后，我们将肿瘤细胞立体定位植入左丘脑（thal），距离bregma后2毫米处。植入后五天进行的三角模态成像显示，所有成像平面上都存在来自表达GV的肿瘤的强烈AM信号。与体外重复诱导时观察到的AM信号衰减一致（见图S1C和S1D），所有三只动物中肿瘤区域的体内非线性波幅调制（xAM）对比度在第11天有所下降，尽管下降的程度和时间在小鼠之间有所不同（见图S2）。在两只动物中，信号在下降之前达到一个早期峰值，而在第三只动物中，信号始终保持较低水平；在所有情况下，xAM的信噪比（CNR）在最后一次会话时显著降低。因此，我们在最后一次成像日进行了BURST成像，以在预计衰减最严重的情况下恢复灵敏度。我们故意将BURST限制在最后一次会话中进行，因为它会破坏所检测到的GV；如果在较早的时间点应用BURST，将会消耗后续非破坏性AM成像所需的GV数量，而将其保留到最后一天可以保持中间会话期间的完整GV信号。fUSI继续揭示视觉诱发的反应，而ULM则实现了肿瘤诱导的血管重塑的纵向映射。小鼠1的所有冠状平面的代表性三角模态图像显示在图2D中，小鼠2和3的相应数据集提供在图S3中。这些结果共同表明，我们的多平面三角模态成像平台能够在同一动物体内联合追踪肿瘤生长、感觉诱发的神经血管反应以及随时间变化的微血管重塑。与死后荧光组织学的共注册（见图2E和S3）证实了超声衍生的肿瘤信号在两只动物中的空间范围（第三只动物的大脑在提取过程中受损）。

**肿瘤生长会位移神经血管定义的脑区并减弱诱发的神经血管反应**

利用我们的纵向数据集，我们量化了肿瘤生长及其对周围脑区的结构影响（见图3A）。我们观察到不同动物之间肿瘤进展模式的差异：在小鼠1中，肿瘤主要侵袭了丘脑区域；在小鼠2中，肿瘤扩散到了丘脑和海马（hipp）；而在小鼠3中，肿瘤主要局限在海马。尽管存在这些差异，所有肿瘤都随时间逐渐扩大，肿瘤平面面积在每次成像会话中持续增加（见图3B），生长速率范围为每天0.37到0.53毫米2，与先前报道的值一致。这种体积扩张伴随着局部结构变形，可见的左侧LGN发生明显位移，该部位靠近植入部位，并且随时间发生了可测量的移位。

**GV表达胶质母细胞瘤的功能和结构效应**

**图3 功能和结构效应**

- **（A）** 植入后第11天，小鼠1、2和3在各自的冠状平面（β-1.9毫米、β-2.2毫米和β-2.5毫米）的三角模态成像。
- **（B）** 不同植入后成像日的肿瘤平面生长情况，以肿瘤面积（毫米2）表示。
- **（C）** 所有时间点（包括基线）左右外侧膝状核（LGNs）的位移幅度。在不同组间观察到显著差异：小鼠1在第8天（p = 0.040）和第11天（p = 0.029）；小鼠2在第4天（p = 0.036）和第8天（p = 0.0037）；小鼠3在第11天（p = 0.014）。
- **（D）** 随时间变化的功能激活与基线比率（ABR）。小鼠1在第11天时左侧LGN的ABR显著低于右侧LGN（p = 0.046）。
- **（B–D）** 实线代表每只动物所有冠状平面的平均值；误差条表示标准误差（SEM）。统计显著性：?p ≤ 0.05 和 ??p ≤ 0.01。**双色?**：表示指定天内左右半球的显著性。所有比较的详细p值详见表S1。
- **（E）** 小鼠1在所有成像日中，冠状平面β = ?1.9毫米的左侧和右侧LGN的平均标准化血流动力学时间过程。灰色阴影表示视觉刺激期间的光照时期。

我们使用基于光流的位移分析来跟踪LGNs随时间的位置变化，并观察到所有小鼠都有可测量的位移，尽管程度不同（见图3C）。与肿瘤相邻侧的LGN位移始终大于对侧LGN，表明肿瘤质量物理上变形了附近的功能性脑结构。在小鼠1和2中，肿瘤近端的位移率显著更高（p < 0.05），而在小鼠3中，尽管变化较为温和但仍可检测到显著位移，这一现象持续到第11天。这些发现与先前在人类患者中的fMRI观察结果一致，其中占位性肿瘤物理上位移了相邻的功能性脑区。尽管肿瘤生长引起了结构变化，但LGNs的视觉诱发的神经血管激活一直持续到第11天，这一点通过fUSI得到证实（见图3D和3E）。然而，这些反应的幅度随着时间的推移在肿瘤相邻侧的LGNs中下降，表现为激活与基线比率（ABR）的逐渐降低，该比率是通过每次会话中显著激活的LGN体素的平均信号计算得出的。由于ABR是每个体素的平均值，这种下降反映了激活区域内响应幅度的减少，而不是激活体素数量的变化。这些值是在通过颅窗可访问的所有成像平面上计算的，以确保观察到的效应不是由于平面外的位移造成的。在小鼠1中，左侧LGN的ABR在第11天显著下降。小鼠2也表现出类似的趋势，尽管左侧LGN的减少与对侧侧没有显著差异，可能表明网络级别的适应性调整更为微妙或对称。在小鼠3中，观察到两侧ABR的下降，这可能反映了系统性影响，如觉醒状态改变、颅内压力或整体血流动力学变化。总之，在这个概念验证队列中，该平台能够在单个动物体内检测到血流动力学定义区域的结构位移以及肿瘤相邻侧刺激诱导的神经血管反应的逐渐减少。重要的是，我们的三角模态成像方法提供了捕捉这种动物间变异所需的灵敏度和空间分辨率，突显了它在解析个体动物肿瘤-脑相互作用模式方面的价值。关于胶质母细胞瘤如何影响大脑功能的生物学结论将需要更大规模、具有适当统计功效的队列来证实。

**肿瘤进展会破坏局部血流和血管结构**

我们使用小鼠1的数据进行了ULM量化，该动物的所有五个会话的ULM系列都完整且无伪影；在小鼠2中，第4天和第8天声透窗口下积累的空气导致了微泡追踪的退化（见图S3），从而无法进行纵向量化。因此，我们使用小鼠1来说明该平台能够分辨的血管变化，并在图S3中展示了小鼠2和3的定性微血管图像。下述所有比较都在小鼠1的五个成像冠状平面内进行（见图4）。我们定义了三个感兴趣的解剖区域（ROIs）：大脑皮层、左侧皮层下层（靠近肿瘤）和右侧皮层下层，并量化了这些区域内的血管位移随时间的变化（见图4A和4B）。在一个代表性的冠状平面中进行的光流基础运动分析显示，从植入后第5天开始，左侧皮层下层的血管开始逐渐重组，而皮层和对侧皮层的运动相对较少（见图4B）。来自所有成像冠状平面的量化数据显示，从第5天开始，肿瘤相邻的左侧皮层下的总血管位移显著大于右侧皮层下的位移（曲线下的双色星号）。尽管皮层和对侧皮层的运动相对于基线也有增加，并在第11天达到显著性（曲线上的单色星号），但肿瘤周围区域的位移幅度明显更高。这些发现支持肿瘤扩张驱动局部微血管重塑以满足其不断增长的代谢需求的假设。

**图4 小鼠1中肿瘤诱导的微血管改变的量化**

- **（A）** 多个时间点下皮层（黄色）、左侧皮层下层区域（红色）和右侧皮层下层区域（蓝色）的微血管位移的光流表示。箭头指示位移的方向和幅度。
- **（B）** 不同时间点每个区域的位移幅度。与右侧皮层和皮层相比，肿瘤植入后左侧皮层下层的血管运动显著增加（曲线下的双色星号）。在左侧皮层下层，所有植入后的时间点的位移也显著大于基线（曲线上的单色星号）。实线代表所有冠状平面的平均值。误差条表示标准误差（SEM）。
- **（C）** 在成像体积内（β = ?1.7到?2.5毫米，0.2毫米递增）的轴向微泡速度的二维最大强度投影（MIP）图。
- **（D）** （C）中白色虚线框所标出区域的放大视图，突出显示了四个代表性血管（白色箭头1–4）随时间的轨迹。
- **（E–H）** 肿瘤周围（左侧）区域和对侧区域的微血管指标量化。实线代表所有冠状平面的平均值。误差条表示标准误差（SEM）。
- **（E）** 帧与帧之间的平均微泡轨迹长度，（F）平均轴向流速，（G）平均微泡密度，以及（H）平均血管迂曲度。统计显著性：?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，和 ???p ≤ 0.001。**绿色?**：表示指定天内左侧ROI与基线的显著性。所有比较的详细p值详见表S2。

为了进一步探索肿瘤核心内的血管变化，我们投影了不同时间点的轴向微泡速度的最大强度图（见图4C和4D）。随着肿瘤的扩张，一些先前可识别的血管从原始位置发生了位移（箭头1、2和3），同时肿瘤区域内出现了新的血管（箭头4），包括一些仅在后期阶段出现的血管，例如第8天。这种动态重组突显了生长中的肿瘤mass内的活跃血管生成和血管招募。然后，在包含肿瘤周围区域的固定ROI内量化了血管指标，包括位移的LGN（白色虚线框，见图4C和4D），并将其与对侧半球的镜像区域进行了比较。在肿瘤周围的（左侧）ROI中，微泡在连续超声帧之间的平均轨迹长度从基线的0.290 ± 0.044毫米减少到第8天的0.276 ± 0.033毫米，再到第11天的0.246 ± 0.022毫米，这种变化具有统计学意义，表明由于肿瘤压迫或重塑导致血管通路变窄或阻塞（见图4E）。相比之下，对侧（右侧）ROI的微泡轨迹在整个过程中保持稳定（约0.290毫米），表明未受肿瘤影响的区域中的血流动态保持完整。在轴向流速中也观察到了类似的模式：在肿瘤周围的ROI中，流速从基线的4.3 ± 0.24毫米/秒下降到第11天的3.7 ± 0.15毫米/秒，从第8天开始显著减少（见图4F）。对侧ROI也显示出轻微的下降，但这种变化没有达到统计学显著性，这进一步证实了肿瘤诱导的血流动力学破坏的局部性质。在两个ROI中，微泡密度在早期时间点保持稳定（约2,500/mm2），但在第11天降至2,100/mm2，表明随着肿瘤的扩张，保持通畅和灌注的血管比例减少。这种减少可能反映了肿瘤血管中先前描述的血管修剪或分流机制。最后，左侧ROI区域的血管扭曲程度从基线的2.39 ± 0.062增加到第11天的2.50 ± 0.065，虽然增幅不大且不具有统计学意义（见图4H），这一趋势与肿瘤诱导的血管生成导致的组织紊乱相符，但在本次研究中未达到显著性。血管扭曲程度的增加以及ULM微泡密度的平稳或下降趋势，都与U87异种移植瘤中预期的VEGF驱动的血管生成过程一致。ULM仅能检测到灌注量超过其检测阈值的血管，而肿瘤新生血管可能不成熟、弯曲，并且由缓慢、不均匀的血流灌注，因此在血管生成活跃的情况下也可能被低估。同时，压迫、共占和修剪作用减少了原有的血管数量，这表现为密度的下降、轨迹长度的缩短和流速的减慢。因此，测得的密度可能反映了新形成的临界以下血管与原有成熟灌注血管之间的平衡，并不一定会在血管生成活跃时上升。总的来说，这些血管变化（机械位移、血流限制、血管生成以及最终的结构不稳定）展示了胶质母细胞瘤生长如何重塑大脑的血管网络以维持自身的生存，这一过程通过我们的三模态成像方法在体内以高空间和时间分辨率被捕捉到。

肿瘤进展会重塑单个动物中的区域间神经血管连接性。虽然我们之前的研究显示，尽管存在机械位移，丘脑核团（LGNs）仍能保留刺激引发的神经血管反应，但我们接下来试图研究胶质母细胞瘤生长如何影响通过fUSI可测量的更广泛的神经血管网络。为此，我们量化了静息状态下的神经血管连接性，以记录未受干扰的动物在连续10分钟内的自发CBV（脑血容量）波动。对于所有三只小鼠，我们使用Paxinos和Watson小鼠脑图谱来定义冠状平面内肿瘤最大且可以同时捕捉到多个脑结构的ROI区域（见图5A–5F）。这些区域包括皮层、胼胝体（c-c）、海马体（hipp）、丘脑（thal）和下丘脑（hyp-thal）。从这些ROI区域得到的神经血管连接性矩阵（见图5B–5D和5F）显示，在基线状态下存在强烈的双侧对称性关联模式，表现为皮层内以及丘脑和海马体之间的强相关性。随着肿瘤的进展，所有小鼠的丘脑连接性都减弱了，而在第11天时，第1只小鼠的皮层连接性也下降，表明整体网络不稳定；第2和第3只小鼠的下丘脑连接性在后期有所增加，这可能是由于皮下网络中的补偿性重组或不适应性的过度连接。这些一致性的观察结果提出了一个假设，需要在更大的样本群体中验证其群体效应。

图5 表明GV表达肿瘤进展对功能性脑连接性的影响

图5A、C和E 显示了用于连接性分析的感兴趣区域（ROIs）：小鼠1（AP平面：β = ?1.9 mm），小鼠2（β = ?2.2 mm）和小鼠3（β = ?2.5 mm）。ROI包括皮层、胼胝体（c-c）、海马体（hipp）、丘脑（thal）和下丘脑（hyp-thal）。
图B、D和F 功能性连接性矩阵显示了不同成像会话（基线1、基线2以及植入后第5/8/11天的小鼠1；小鼠2和3的相应会话）之间ROI之间的相关值。
图G–I 以初级体感皮层（S1）为种子区域得出的连接性图谱。使用绿色地图可视化相关强度，并在静息状态下fUSI采集的时间平均功率多普勒图像（灰色地图）上叠加了第11天GV表达肿瘤信号的热色地图。

作为肿瘤生长过程中矩阵级变化的总结指标，我们计算了每只动物网络的侧向对称性，即每个ROI与其对侧同源结构之间的平均相关性（见图S4）。由于肿瘤是单侧的，因此半球间对称性的丧失提供了一个衡量网络破坏或位移的简洁指标。小鼠1和2在植入前的基线水平相对一致（0.42–0.44），但在第11天时明显下降（分别降至0.29和0.33）。相比之下，小鼠3的两个基线水平之间存在较大差异（0.48和0.35），其第11天的值（0.46）仍保持在这个范围内，与其扩张的而非退化的连接性模式相符（详见后续章节）。在半球间连接性矩阵（见图S4B–S4D）中，这种模式表现为小鼠1和2的同源对角线逐渐变暗，而小鼠3的第11天对角线强度相对保持稳定。

为了进一步探究肿瘤特异性动态，我们计算了随时间变化的CBV（脑血容量）的体素级百分比变化（见视频S1和S2）。有趣的是，肿瘤区域本身表现出一致的空间均匀CBV波动，似乎与周围脑网络无关（例如，视频S1中的T= [100–130秒]，视频S2中的T= [28–55秒]）。与通常由解剖学上连接区域协调活动产生的生理功能性信号不同，这些肿瘤相关的波动缺乏与其他脑区域的同步相关性。这种空间和时间上的隔离表明肿瘤产生了自主的血液动力学活动，这一点最近通过多光子显微镜得到了证实。

作为肿瘤诱导的网络重组的例证，我们使用初级体感皮层（S1）作为种子区域进行了基于种子的连接性分析（见图5G–5I）。在基线状态下，所有小鼠的S1与对侧皮层之间都表现出强烈的双侧对称性连接，这与已知的脑半球间感觉网络协调一致。然而，在植入后第11天，不同小鼠之间的连接性模式明显分化。在小鼠1中，肿瘤主要在丘脑区域扩展，导致S1连接性显著下降，半球间关联减弱，与周围皮层区域的整合减少。相比之下，第2和第3只小鼠的肿瘤扩展到了海马体，表现为S1连接性增强，种子网络覆盖了更广泛的同侧和对侧皮层区域。这些不同的轨迹显示了局部肿瘤生长对皮层网络的不同和广泛影响，表明肿瘤可能会根据其解剖位置和局部回路相互作用诱导出退行性和补偿性的功能连接性重塑。

综上所述，这些结果展示了胶质母细胞瘤进展对功能性脑结构的深远和动态影响及其在个体间的变异性。除了局部位移和损伤外，肿瘤还重塑了全球网络拓扑，形成了异常的、以肿瘤为中心的枢纽，并重新配置了连接模式。这些个体层面的发现证明了该平台能够捕捉多个冠状平面上的分布式和演变中的神经血管连接性变化，并为更大规模的群体研究提供了依据，以便测试肿瘤诱导的网络重组的群体效应。

讨论

我们的研究介绍并验证了一个多平面三模态超声成像平台，该平台利用基因编码的肿瘤标签、血流动力学功能成像和超高分辨率血管映射技术，无创地监测GV表达U87异种移植瘤的体内生长及其结构、微血管和神经血管相关性。这种方法允许在个体基础上进行高分辨率的长期观察肿瘤-大脑相互作用。我们的分析揭示了肿瘤半球内功能性区域（如LGNs）的显著位移，同时进行的ULM成像显示了广泛的血管重塑，包括微泡轨迹长度和流速的减少，以及血管扭曲程度的增加，这与肿瘤诱导的血管生成一致。尽管存在物理扭曲，我们仍观察到LGNs中持续的但减弱的视觉诱发神经血管反应，这种模式与位移区域中保留的感觉驱动一致，但我们在此并不将其解释为在没有正交电生理学验证的情况下神经功能的直接指标。通过全脑功能连接性分析，我们观察到不同小鼠间区域间连接性的重塑，某些情况下甚至扩展到了肿瘤生长区域之外的区域。

该平台的价值不仅在于其三个独立的输出结果，这些结果可以单独获得，而在于它们在同一动物和同一会话中的共同注册使得这种分析成为可能。首先，我们可以将功能性结构（视觉诱发的LGN）的位移和减弱归因于扩张的肿瘤 mass，因为GV通道在同一帧中定义了肿瘤，而fUSI和ULM在同一帧中测量了诱发反应和局部血管，这些测量结果是一致的，而不是事后对齐的。其次，我们将网络解耦的CBV波动归因于肿瘤（见图5；视频S1和S2），这可以解释为肿瘤固有的特征，因为分子通道独立地定义了肿瘤范围。第三，重复对同一动物进行成像，随着肿瘤的生长，我们可以顺序观察肿瘤扩张、血管重塑和神经血管反应性的下降，而不是在不同的组间进行比较。MRI和PET缺乏这种分子特异性、分辨率以及能够观察清醒状态动物的能力。这些是概念验证阶段的协同观察结果；在更大规模的样本群体中验证这些结果将需要后续的研究。

尽管本研究的目标是介绍和验证我们的多模态平台，但该方法还有几个重要的扩展方向。例如，我们可以测试不同的变量以进一步探究系统的可扩展性。我们这里关注的是单一肿瘤模型U87胶质母细胞瘤，这虽然被广泛使用，但并不能完全反映更复杂的模型（如弥漫性内生脑桥胶质瘤或转移性级联）的侵袭性。将该平台应用于更小或更分散的肿瘤模型也有助于确定其敏感性。此外，我们的工作仅限于左侧丘脑的单一植入部位和一种诱发感觉范式（视觉刺激）。探索大脑其他区域的植入部位，以及结合听觉或体感刺激等其他范式，可以提供更全面的肿瘤诱导功能障碍视图。此外，该平台还可以用于结合治疗，以研究治疗对肿瘤及其周围神经回路的影响。它还为将fUSI与基因编码的钙或电压指示器结合提供了基础，从而提供了细胞类型特异性或神经递质特异性动态的独特视角，并结合了全脑血流动力学。最后，尽管我们的样本量有限，但可重复的趋势表明未来的研究可以验证这些发现的普遍性，并确定肿瘤相关的大脑活动变化是否在不同个体间具有保守性。

总之，这些结果强调了胶质母细胞瘤进展对功能性脑结构的深远和动态影响及其在个体间的变异性。除了局部位移和损伤外，肿瘤还重塑了全球网络拓扑，形成了异常的、以肿瘤为中心的枢纽和连接模式的重新配置。这些个体层面的发现展示了该平台捕捉多个冠状平面上分布式和演变中的神经血管连接性变化的能力，并为更大规模的群体研究提供了基础，以测试肿瘤诱导的网络重组的群体效应。

讨论

我们的研究介绍并验证了一个多平面三模态超声成像平台，该平台利用基因编码的肿瘤标签、血流动力学功能成像和超高分辨率血管映射技术，无创地监测GV表达U87异种移植瘤的体内生长及其结构、微血管和神经血管相关性。这种方法允许在个体基础上进行高分辨率的长期肿瘤-大脑交互观察。我们的分析揭示了肿瘤半球内功能性区域（如LGNs）的显著位移，同时对ULM进行量化显示了广泛的血管重塑，包括微泡轨迹长度和流速的减少，以及血管扭曲程度的增加，这与肿瘤诱导的血管生成一致。尽管存在物理扭曲，我们仍观察到LGNs中持续的但减弱的视觉诱发神经血管反应，这种模式与位移区域中保留的感觉驱动一致，但在这里我们并不将其解释为在没有正交电生理学验证的情况下神经功能的直接指标。通过全脑功能连接性分析，我们观察到不同小鼠间区域间连接性的重塑，某些情况下甚至扩展到了肿瘤生长区域之外的区域。

该平台的价值不仅在于这三个独立的输出结果，这些结果可以分别获得，而在于它们在同一个动物和同一会话中的共同注册。首先，我们可以将功能性结构（视觉诱发的LGN）的位移和减弱归因于扩展的肿瘤质量，因为GV通道在同一帧中定义了肿瘤，而fUSI和ULM在同一帧中测量了诱发反应和局部血管，这两个过程的测量结果是一致的。其次，我们将网络解耦的CBV波动归因于肿瘤（见图5；视频S1和S2），这可以解释为肿瘤固有的特征，因为分子通道独立定义了肿瘤范围。第三，随着肿瘤的增长重复对同一动物进行成像，使我们能够在同一动物内部而不是在不同组间顺序观察肿瘤扩张、血管重塑和神经血管反应性的下降。MRI和PET缺乏这种分子特异性、分辨率以及在清醒状态下观察动物的能力。这些是在概念验证阶段的协同观察结果；在更大规模的样本群体中验证这些结果将需要后续的研究。

虽然本研究的目标是介绍和验证我们的多模态平台，但该方法还有几个重要的扩展方向。例如，我们可以测试进一步探究系统可扩展性的变量。我们在这里关注的是单一肿瘤模型U87胶质母细胞瘤，尽管它被广泛使用，但并不能完全反映更复杂的模型（如弥漫性内生脑桥胶质瘤或转移性级联）的侵袭性。将该平台应用于更小或更分散的肿瘤模型也有助于确定其敏感性。此外，我们的工作仅限于左侧丘脑的单一植入部位和一种诱发感觉范式（视觉刺激）。探索大脑其他区域的植入部位，以及结合听觉或体感刺激等其他范式，可以提供更全面的肿瘤诱导功能障碍视图。此外，该平台还为超出肿瘤特征的广泛应用打开了大门。它可以与治疗结合，研究治疗对肿瘤及其周围神经回路的影响。它还为通过将fUSI与基因编码的钙或电压指示器结合来整合分子级输出提供了基础，提供了独特的窗口，以便了解细胞类型特异性或神经递质特异性动态以及全脑血流动力学。最后，尽管我们的样本量有限，但可重复的趋势表明未来的研究可以测试这些发现的普遍性，并确定肿瘤相关的大脑活动变化是否在不同个体间具有保守性。

总之，这些结果强调了结构破坏、血管重塑和功能网络重组之间的复杂相互作用。我们的平台能够在清醒动物体内捕捉肿瘤进展的所有三个维度，这在研究神经肿瘤学过程中是一个重大进步，具有空间和时间精度，并有助于开发改进的治疗方法。

研究的局限性

这项工作旨在作为方法演示，而不是一个决定性的生物学研究，在解释结果时应考虑几个限制。首先，我们的样本由三只小鼠组成。因此，所有定量比较都是在同一动物内的不同成像平面和时间点之间进行的，这里报告的每个受试者的趋势旨在激励更大规模的群体研究，而不是替代它们。其次，fUSI提供的是通过神经血管耦合来表征的神经活动，而不是直接测量尖峰或突触活动。尽管fUSI已经在健康大脑中与电生理和光学记录进行了广泛的验证，但在肿瘤携带的大脑中，血流动力学信号与潜在的神经活动之间的关系可能受到血管重塑和代谢竞争的影响，这可能会干扰神经血管耦合本身。因此，诱发的或静息状态下的血流动力学信号的减少并不必然意味着神经活动的相应减少。未来的研究需要将这一平台与电生理学、光遗传学刺激或基因编码的钙/电压报告蛋白结合，以区分这些因素的贡献。第三，此处报告的成像体积是多层2D冠状扫描的堆叠（每只动物五个平面，间距0.2毫米），覆盖了植入区域，并非完整的3D扫描。要在单次扫描中覆盖整个大脑，需要使用矩阵或行列阵列探针，这是正在进行的仪器开发工作的一个目标。第四，U87是一种永生化的人类胶质母细胞瘤细胞系，在免疫缺陷的宿主体内能够形成边界清晰的异种移植瘤。它并不能再现临床胶质母细胞瘤的弥漫性浸润特征或免疫ocompetent（具有正常免疫功能的）大脑中的肿瘤-免疫相互作用。因此，我们将U87作为平台验证模型进行介绍；将该平台应用于患者来源的异种移植瘤、在immuneocompetent宿主体内的同基因原位模型以及弥漫性 intrinsic pontine glioma (DIPG) 等模型是下一步明确的步骤。第五，此处报告的组织学验证利用了植入细胞的天然RFP/GFP荧光来确认肿瘤的位置和范围（图2E和S3）。我们没有进行CD31或其他血管标记物的共染色，因为组织已经经过处理以保持天然荧光；将该平台与ULM衍生的微血管图的CD31/凝集素共注册配对是重要的下一步，最好在专门的免疫组化队列中进行。第六，重复使用多西环素诱导后，GV的表达会下降（图S1C和S1D）。我们注意到，信号的非线性下降可能反映了表达GV的细胞比例逐渐减少，而不是转导构建体的丢失，这可能是由于低表达或非表达细胞（其代谢负担低于表达GV的细胞）的生长和/或GV基因组随时间的转录沉默所致。与群体-Level效应一致，双阳性细胞的比例在连续的诱导轮次中有所下降（图S1A和S1B）。我们没有进行必要的实验来区分这些机制；由于传代过程需要离心，这本身会独立于诱导过程降低信号，因此无法在这里清楚地区分它们。我们通过在最后一天切换到BURST成像来弥补这一点，但更稳定的表达策略将有利于持续超过两周的研究。

尽管存在这些限制，这里展示的平台在同一只清醒动物中随时间提供了分子、血流动力学和微血管读数的独特组合，这是目前任何单一方法都无法提供的。我们预计，随着上述问题的解决，这一平台的性能将得到进一步提升。

资源可用性
主要联系人
更多信息和资源请求应联系主要联系人Mikhail G. Shapiro（[e-mail]），他将负责满足这些请求。

材料可用性
用于生成表达GV的U87细胞系的GV表达构建体最初由Shivaei等人描述，他们的设计和表征已完整报道。这些质粒将存放在Addgene，并在该研究发表后将公开可用。在此期间，以及本研究生成的所有其他质粒和表达GV的U87细胞系，材料可通过与加州理工学院的材料转让协议从主要联系人处获得。

数据和代码可用性
支持本研究主要发现的代表性三模态超声数据集已存放在Zenodo，并在发表日期之前公开可用。DOI列在关键资源表中。所有原始代码也已存放在Zenodo，并在发表日期之前公开可用。DOI也列在关键资源表中。如果需要重新分析本文报告的数据，可从主要联系人处获取更多信息。

致谢
本工作部分得到了人类前沿科学计划跨学科奖学金（LT000217/2020-Cto C.R.）、美国国立卫生研究院（R01-EB018975和R01NS120828给M.G.S.）、The Mark基金会（给M.G.S.）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（给S.S.）以及霍华德·休斯医学研究所（给M.G.S.）的支持。

作者贡献
概念设计：C.R.和M.G.S.；基因设计和慢病毒递送：S.S.；手术和体内实验：C.R.；ULM实验设计和处理：B.H.；组织学：G.D.；超声数据处理和分析：C.R.；研究监督：M.G.S.；写作：C.R.、S.S.、B.H.和M.G.S.

利益声明
S.S.和M.G.S.是专利US20230094152A1“病毒递送气体囊泡基因”的作者。

生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的使用
在准备本工作时，作者使用了ClaudeAI来提高手稿的清晰度和可读性，通过精炼措辞和语言质量，并帮助压缩方法描述的表述，同时不改变其科学内容。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对公布的文章内容负全部责任。

STAR★方法
关键资源表

**试剂或资源**
**来源标识符**
细菌和病毒株
慢病毒：pLV-TRE-GvpA-IRES-RFP; EF1a(min)-rtTA：本论文
慢病毒：pLV-TRE-gvpNJKFGWV-GFP：本论文
化学物质、肽和重组蛋白
DMEM（高葡萄糖）、GlutaMAX、丙酮酸钠：Gibco（Cat#10569）
HEPES：1 M：Cytiva（Cat#SH30237）
MEM非必需氨基酸（100x）：Gibco（Cat#11140）
胎牛血清：bio-techne（Cat#S10350）
聚乙烯亚胺（PEI）：Polysciences（Cat#49553-93-7）
丁酸钠：Sigma Aldrich（Cat#K0875）
Polybrene：Millipore Sigma（Cat#TR100）
多西环素盐酸盐：Millipore Sigma（Cat#PHR1145）
胰蛋白酶/EDTA（0.25%）：Corning（Cat#25-053-CI）
Perflutren脂质微球 [Definity]：Lantheus（Cat#DE16）
酮洛芬：Ketofen（Cat#100040）
丁丙诺啡（缓释型，Ethiqa XR）：Fidelis Animal Health（Cat#86084-100-30）
布比卡因：Pfizer（Cat#00409-5010-25）
异氟烷：Kent Scientific（Cat#ISO-6）
Tetric EvoFlow UV-固化复合材料：Ivoclar Vivadent（Cat#595953）
WWC&B Metabond牙科水泥：Patterson Dental（Cat#75533559）
琼脂糖：Sigma Aldrich（Cat#A9539）
甲醛（4%）：Lab Alley（Cat#C3966）

**关键商业检测试剂**
Annexin V结合物：Invitrogen（Cat#A35136）
SYTOX Blue死细胞染色剂：Invitrogen（Cat#S34857）

**存档的数据**
代表性三模态数据集和分析脚本：**
本论文：Zenodo：https://doi.org/10.5281/zenodo.22016440

**实验模型**
**细胞系**
人类：U-87 MG胶质母细胞瘤：ATCC（Cat#HTB-14；RRID：CVCL_0022）
人类：HEK293T：ATCC（Cat#CRL-3216；RRID：CVCL_0063）
人类：表达GV的U87（本论文）：本论文
**生物体/菌株**
小鼠：NOD scid gamma（NSG），雄性和雌性，6-14周龄：The Jackson Laboratory（株号#005557；RRID：IMSR_JAX：005557）

**软件和算法**
MATLAB [R2023b]：MathWorks（RRID：SCR_001622）
GraphPad Prism：GraphPad（RRID：SCR_002798）
Vantage软件/API：Verasonics（N/A）
ZEN Blue：Carl Zeiss（RRID：SCR_013672）
BioRender：BioRender（RRID：SCR_018361）

**其他**
Vantage可编程超声系统：Verasonics（Vantage 256L22-14vX 128元素线性阵列换能器）
Verasonics（L22-14vX Mobile Home）
笼头固定系统：Neurotar（Cat#NTR000251-06）
聚甲基戊烯（TPX）薄膜：Sigma Aldrich（GF69297687）
MACS Quant VYB流式细胞仪：Miltenyi Biotec（RRID：SCR_020268）
LSM980共聚焦显微镜：Carl Zeiss（LSM98033）
G针头：BDCat#3051
微量注射泵：World Precision Instruments（Cat#AL-1000）

**实验模型和研究参与者详情**
所有动物程序均符合加州理工学院（Protocol 1761）的机构动物护理和使用委员会指南，并且所有实验均符合相关监管标准。使用的免疫缺陷NOD scid gamma小鼠（NSG；NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ；The Jackson Laboratory，株号#005557；RRID：IMSR_JAX：005557）为6-14周龄，体重19.5–25.5克，在进行颅骨窗口手术时使用。该菌株由供应商维持为纯系群体，未进行进一步回交。NSG小鼠缺乏成熟的T和B淋巴细胞以及功能性自然杀伤细胞，并且在细胞因子信号传导方面存在缺陷；因此，所有动物都在针对免疫缺陷菌株的特定饲养和处理条件下进行维护，使用经过消毒的笼子、食物和水。所有小鼠在进入本研究前均未经任何处理。小鼠被分组饲养，在12小时光照/12小时黑暗的周期下生活，室温保持在20–26°C，相对湿度为30–70%，并且可以自由获取食物和水。每次手术后，小鼠会被转移到相同免疫缺陷饲养条件下的新笼子中单独饲养三天；如果未观察到争斗行为，则将它们放回群体饲养。使用了3只小鼠。由于这是一项概念验证的STAR方法演示，因此没有进行正式的样本量估计；选择队列规模是为了证明三模态采集的可行性，而不是为了进行组间比较。所有小鼠都接受了相同的干预（单侧肿瘤植入），并在两次植入前的基线会话中作为自身对照，因此无法进行随机分组和盲法处理。虽然使用了雄性和雌性小鼠，但由于N=3，无法分析性别对结果的影响或关联，因此性别未被视为生物学变量（小鼠1=雌性，小鼠2=雌性，小鼠3=雄性）。缺乏基于性别的分析限制了结果的普遍性，这在研究的局限性部分进行了讨论。

**细胞系**
使用的细胞系包括U87人胶质母细胞瘤细胞（ATCC，Cat#HTB-14；RRID：CVCL_0022），来源于雄性供体，以及HEK293T细胞（ATCC，Cat#CRL-3216；RRID：CVCL_0063），来源于雌性供体。这两个细胞系直接从ATCC获得，未经进一步验证，也未检测其支原体污染情况。我们依赖于供应商对收到股票的认证。HEK293T细胞最多传代了20次。
两个细胞系均在37°C和5% CO2的DMEM+培养基中培养，培养基配方包括高葡萄糖DMEM、GlutaMAX（Gibco，Cat#10569）、丙酮酸钠（1 mM，Gibco，Cat#10569）、20 mM HEPES（Cytiva，Cat#SH30237）、1x MEM非必需氨基酸（0.1 mM，Gibco，Cat#11140）和10%胎牛血清（bio-techne，Cat#S10350）。用于本研究的表达GV的U87细胞系也是在相同条件下维持的；其来源在方法细节中有所描述。

**方法细节**
**细胞工程和体外验证**
慢病毒生产
GV表达是通过两个先前建立的慢病毒载体实现的，这两个载体共同编码了Anabaena flos-aquae中形成气体囊泡所需的八个基因。第一个载体编码气体囊泡蛋白A（GvpA）、内部核糖体进入位点（IRES）和红色荧光蛋白（RFP），这些基因都在四环素响应元件（TRE）的控制下，并带有反向四环素控制的转录激活因子（rtTA），可以在多西环素诱导下表达。第二个载体编码组装基因gvpN、J、K、F、G、W和V以及绿色荧光蛋白（GFP），同样在TRE的控制下。这两个荧光标记物的使用仅为了便于工程操作。

HEK293T细胞接种在10厘米培养皿中，直到细胞密度达到80-90%。准备了22 μg pLV（含有目标基因的质粒）、22 μg pCMVR8.74（Addgene #22036）和4.5 μg pMD2.G（Addgene #12259）的混合物。这些质粒与聚乙烯亚胺（PEI，Polysciences）以2.8:1的PEI与DNA质量比混合，在室温下孵育12分钟，然后加入到细胞中。细胞在37°C和5% CO2条件下孵育12小时。之后，换为添加了10 mM丁酸钠的10 mL新鲜DMEM+培养基，并孵育8小时。48小时后，收集旧培养基并在500 x g下离心10分钟以去除碎片。病毒上清液在4°C下储存，并在收集后24小时内用于转导。

**转导和多西环素诱导**
U87细胞在转导前24小时接种在DMEM+培养基的6孔板中，培养至70-90%密度。将500 μL每种慢病毒加热至37°C后加入每个孔中，同时加入10 μg/mL的Polybrene（Millipore Sigma，Cat#TR1003）。细胞培养板在35°C下以800 x g离心50分钟，然后在37°C下孵育16-20小时。之后移除病毒培养基，并对细胞进行传代以备后续使用。

**诱导和多西环素处理**
细胞在转导前72小时用多西环素（1 μg/mL）处理72小时。在三轮诱导之间，每隔三天重复一次诱导，以匹配体内成像会话的间隔。通过流式细胞术（MACSQuant VYB）测量转导效率和双阳性（GFP+/RFP+）细胞的比例。根据SSC-A与SSC-H散射对单细胞群体进行分选。在这个群体中，双阳性事件基于RFP（mScarlet-I）和GFP（mEGFP）的荧光强度进行分选。每个实验中都包含了野生型细胞以指导荧光门的选择。每个样本至少记录了1000个单细胞事件。

**细胞活力检测**
转导后的细胞活力使用Annexin V（Invitrogen，Cat#A35136）和SYTOX Blue（Invitrogen，Cat#S34857）染色进行评估，按照制造商的协议进行，比较未诱导细胞和经多西环素处理的细胞。具体来说，细胞先与Annexin V孵育30分钟，然后与SYTOX Blue孵育15分钟，再离心并悬浮在1X PBS中。荧光使用MACSQuant VYB进行测量。

**体外超声成像**
为了可视化表达GV的胶质母细胞瘤细胞，我们利用了GV的非线性声学散射特性，这种特性源于压力下壳层的可逆屈曲。体外成像采用了非线性交叉传播波幅调制（xAM）超声成像技术，这是一种基于平面波的技术，能够在两个倾斜波前的交点产生局部振幅调制。这种几何结构将非线性对比度的产生限制在焦点区域，同时最小化了由传播引起非线性效应所带来的背景信号积累。1×10^6个野生型（WT）未诱导和诱导表达GV的胶质母细胞瘤细胞被以相同的接种密度和培养计划分别接种在不同的孔中，并嵌入1%琼脂糖幻影中，然后置于1×PBS溶液中进行成像。成像使用了与体内实验相同的Verasonics Vantage系统和L22-14vX 128元素线性阵列，由自定义的MATLAB脚本控制。非线性xAM图像的获取参数包括交叉传播半角α=19.5°、65元素发射孔径（中心元素被关闭），以及每帧64条射线线，所有128个通道在接收时均处于活跃状态。每条射线线采用三脉冲振幅调制序列（一次全孔径发射后跟两次半孔径发射），发射波形为15.625 MHz的两个半周期，每条射线线进行50次积累。射频数据以62.5 MHz的采样率采集（每个波长4个样本），扫描深度范围为1–8 mm，假设声速为1500 m/s。相同孔的线性B模式图像则使用40元素发射孔径和5 mm焦点进行聚焦发射。发射电压根据交叉传播角度和深度从氢敏探头校准表中确定，目标是在成像平面上产生300 kPa的峰值负压。所有条件均在同一实验日内、相同采集参数下进行，以最小化成像设置或环境因素造成的变异。

在进行开颅手术之前，首先对小鼠进行称重，并用4%异氟烷吸入麻醉，整个手术过程中维持1-2%的异氟烷浓度。使用加热垫将体温保持在37摄氏度。为了术后镇痛，皮下注射150 μL酮洛芬（1 mg/mL）、50 μL缓释丁丙诺啡（Ethiqa XR，1.3 mg/mL）和50 μL布比卡因（0.5 mg/mL），其中布比卡因直接注射到切口部位。剃除头皮并用氯己定清洁，然后切开头皮暴露颅骨。使用带有钢钻头的微型钻头进行开颅手术，切除从前后（AP）坐标-0.5 mm到AP -3.5 mm以及内外（ML）坐标-2.5 mm到ML +2.5 mm范围内的颅骨段，同时注意保护硬脑膜的完整性。切除的颅骨被替换为相同大小的透明聚合物（TPX）窗口（厚度125 μm）。该窗口使用紫外线固化的复合材料（Tetric EvoFlow）固定在颅骨上，并用牙科水泥（Metabond，Patterson Dental）加固。为了便于在头部固定的装置中进行成像，还制作了一个定制设计的头板，将透明窗口固定在水泥基础上。这个头板设计用于与Mobile HomeCage系统配合使用，可以实现稳定的头部固定，同时允许动物在行为笼内自由移动。术后恢复迅速（3天内），动物表现正常，包括精神明亮、警觉且反应良好。

在小鼠体内植入GV表达的U87细胞之前，先在无多西环素诱导的情况下培养至少两代细胞。在植入当天，使用0.25%的胰蛋白酶/EDTA（Corning，Cat#25-53-CI）分解细胞，以500 x g的离心速度离心5分钟，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，细胞浓度约为每毫升6000万个。细胞随后在冰上保存最多2小时，待注射。

在两次基线记录会话之后，将GV表达的U87胶质母细胞瘤细胞通过立体定向技术植入小鼠的大脑中。小鼠再次称重，并用4%异氟烷吸入麻醉，整个手术过程中维持1-2%的异氟烷浓度。使用加热垫将体温调节在37摄氏度。通过皮下注射150 μL酮洛芬（1 mg/mL）提供镇痛。在透明窗口上使用微型钻头在相对于bregma的前后（AP）坐标-4 mm和内外（ML）坐标+1.5 mm处制造一个小入口孔。将33G针头（World Precision Instruments）连接到微量注射器（Hamilton）上，以45度角插入大脑4毫米深，到达目标肿瘤植入位置：AP -2 mm、ML +1.5 mm和背腹（DV）-3.5 mm。使用微量注射泵（World Precision Instruments）以5-7 nL/s的流速注入肿瘤细胞，总共注入1.5-3 μL的细胞液。等待5分钟让细胞稳定后，轻轻拔出针头，并用紫外线固化的复合材料（Tetric EvoFlow）封闭入口孔。术后恢复迅速（3天内），动物表现正常，包括精神明亮、警觉且反应良好。

在每次植入成像会话前48小时和24小时，通过腹腔注射多西环素（0.1 mg/mL，150 μL）诱导细胞表达GVs。允许小鼠恢复，并每天监测以确保其健康和稳定性。

成像系统和会话结构采用Verasonics Vantage可编程超声系统进行三模态成像，该系统通过自定义的MATLAB（MathWorks，美国）脚本控制。系统配备L22-14vX 128元素线性阵列换能器，具有0.1 mm的间距、8 mm的升程焦点、1.5 mm的升程孔径、15.625 MHz的中心频率以及67%的-6 dB带宽。每只小鼠接受五次成像会话：两次植入前的基线会话（小鼠1为-5天和-3天），以及三次植入后的会话（小鼠1为第5天、第8天和第11天；小鼠2为第4天、第8天和第11天；小鼠3为第4天、第7天和第11天）。在每次会话中，三种成像模式依次进行，每次间隔几分钟：首先是使用非线性振幅调制成像进行肿瘤可视化，接着是使用fUSI进行大脑活动的功能记录（视觉诱发和静息状态），最后使用ULM进行微血管映射。换能器与透明颅骨窗口之间的声学耦合通过超声凝胶实现。换能器固定在一个定制的3D打印探针支架上，该支架安装在Kopf立体定向框架的臂上，具有数字位置反馈功能，定位精度为10 μm，用于在会话期间在冠状平面之间移动探针。每只小鼠的扫描覆盖五个冠状平面：小鼠1为AP –1.7 mm到–2.5 mm（间隔0.2 mm）；小鼠2为AP –2.2 mm到–2.8 mm（四个平面）；小鼠3为AP –2.1 mm到–2.9 mm。在各会话之间，通过匹配之前会话中获得的B模式和功率多普勒图像来手动重新定位成像平面，利用血管和解剖学标志点进行复位；这种重新定位的可重复性在肿瘤植入前的两次基线会话中得到了验证。

为了减轻压力并确保成像过程中的生理活动，小鼠在第一次成像会话前接受训练，使其适应头部固定的Mobile HomeCage系统（Neurotar，芬兰）。训练过程是在空气缓冲的行为笼中每天放置小鼠1到3小时，持续五天。这个适应期帮助小鼠适应装置，减少了后续成像会话中的压力。在成像当天，通过短暂注射异氟烷（<1分钟）使小鼠短暂麻醉，以便在头部固定装置中牢固定位。一旦头部固定完成，立即停止异氟烷注射，让小鼠恢复意识。成像会话在停止异氟烷后10分钟开始，以确保其完全消退，从而避免可能的混淆因素如血管扩张。

通过125 μm厚的透明聚合物颅骨窗口使用交叉传播波幅调制（xAM）技术对GV表达的肿瘤进行体内成像，相同的Verasonics Vantage系统和L22-14vX阵列也被用于幻影实验。xAM发射的参数包括交叉传播半角α=19.5°、65元素发射孔径以及每帧64条射线线，所有128个通道在接收时均处于活跃状态。每条射线线包含三次发射的振幅调制序列：一次全孔径发射和两次半孔径发射，发射波形为15.625 MHz的两个半周期。成像深度范围为1–8.5 mm，假设声速为1540 m/s，连续射线线采集间隔500 μs，帧间间隔32 ms。射频数据在每次发射后保存，并在重建过程中进行相干叠加。这种序列还用于量化不同成像会话中的非线性肿瘤信号（对比度与噪声比）。在最后一次成像会话（第11天），我们采用了BURST成像技术，该技术结合了振幅调制和时间信号解混，以提高对非线性散射体的敏感度。BURST采集使用40元素发射孔径、6 mm发射焦点和每帧89条射线线的聚焦振幅调制序列，发射波形为18 MHz的七个半周期，扫描深度范围为2–9 mm。每次采集包括在成像电压下记录的10帧，然后在升高的 collapse 电压下记录66帧，帧间隔为20 ms（帧率为50 Hz）；电压切换通过系统的发射功率控制曲线实现。鉴于多次体外多西环素诱导后观察到的信号减弱现象，选择BURST技术以提高可检测性，尽管这种技术会导致GVs的降解，但在最后一次成像当天这是可以接受的。BURST技术仅限于最后一个成像会话，因为提前使用会耗尽后续非破坏性振幅调制成像所需的GVs数量。

功能超声成像（fUSI）通过映射大脑血容量（CBV）的局部变化来可视化神经活动。CBV的变化与神经活动通过神经血管耦合紧密相关，通过计算大脑中的功率多普勒变化来进行评估。每个功率多普勒图像是根据以500 Hz帧率采集的200帧复合图像累积得到的。每帧复合图像是由14个倾斜平面波（角度范围-14度到14度，步长2度）创建的。我们使用7000 Hz的脉冲重复频率。每组200幅图像经过SVD杂波滤波处理，以分离组织信号和血液信号（svd截止值=50），得到反映整个成像平面CBV的最终功率多普勒图像。通过每秒拍摄一张功率多普勒图像的方式创建功能超声录像。

我们使用了针对视觉系统的被动视觉刺激任务。视觉刺激使用蓝光LED（波长450 nm）实现，LED位于小鼠头部前方8厘米处。刺激过程包括蓝光LED的周期性闪烁（闪烁频率5 Hz），具体结构为：30秒黑暗后跟随30秒闪光，重复三次，总时长为180秒。在此距离下，亮灯时的亮度为14 lux，熄灯时的亮度约为0.05 lux。

为了研究功能连接性，我们在没有外部刺激的情况下记录了头部固定清醒小鼠的功能活动，每次成像每个平面记录10分钟，同时将小鼠放置在光线和噪音隔离的实验舱中。

对于ULM，小鼠在成像过程中保持头部固定，以保持探针与成像平面的对齐，并用1.5%的异氟烷麻醉，保持温度在37摄氏度，持续整个采集过程（大约一小时）。通过呼吸率监测麻醉深度。在每次冠状平面扫描前，通过尾静脉导管注射50 μL的活化DEFINITY（Lantheus，Billerica，MA，美国），稀释至原始浓度的1/10。使用超快超声以500 Hz的复合帧率（-5到5度等间隔的6个角度）对开颅后的大脑进行成像，每次采集500帧（1秒）。为了保存数据，会进行暂停，然后重复此过程以获得100,000张图像。传输的脉冲中心频率为15.625 MHz，持续两个周期。在波束形成过程中，假设声速为1540 m/s，从而得出轴向和横向方向上的波束形成像素尺寸为一个波长（98.6 μm），视野范围为72 × 77像素（深度7.1 mm × 宽度7.6 mm）。射频数据以100%的采样率进行采集，并使用Vantage API（Verasonics，美国柯克兰市）提供的延迟求和波束形成器进行处理。波束形成后的数据被裁剪以限制成像区域仅包括大脑，接着通过3阶巴特沃斯带通滤波器在15至249 Hz范围内进行滤波。随后应用自适应时间增益补偿，基于奇异值分解（保留5到500个奇异值）对微泡信号进行增强，再通过同样基于奇异值分解的空间时间杂波滤波器处理（保留3到500个奇异值），即移除能量最高的两个奇异向量。1滞后自相关进一步增强了微泡信号。使用径向对称性算法定位微泡，每帧保留90个最亮的候选点，假设点扩散函数支持的尺寸为3 × 3像素。定位后的结果被渲染到一个超分辨率网格上，其分辨率因子相对于波束形成像素尺寸为10倍，最终重建的像素尺寸为9.86 × 9.86 μm（720 × 770像素）。相邻帧之间的位置对齐采用了Munkres分配算法，最大链接距离为2像素，且不进行间隙闭合，这样如果下一帧未检测到微泡，则终止该轨迹的计算。只有连续15帧（30毫秒）以上的轨迹被保留，并将保留的轨迹放大10倍以用于显示和测速。

在成像过程结束时，小鼠通过心脏灌注0.9%的生理盐水，随后灌注4%的福尔马林生理盐水。取出大脑，在4摄氏度下过夜固定，然后用30%的蔗糖进行低温保护，并在冠状平面上以50 μm的厚度切片，以匹配体内成像切片。使用Zeiss LSM980共聚焦显微镜（ZEN Blue软件）成像慢病毒转导的U87细胞中天然存在的RFP和GFP荧光。小鼠1和小鼠3的切片通过皮层表面和脑室标志物与相应的超声冠状平面对齐；小鼠2在取脑过程中受损，无法进行组织学处理。组织学和体内非线性振幅调制超声信号所测量的肿瘤范围在质量上是一致的。

图表的生成使用了BioRender软件。

在本概念验证研究中，所有的定量比较都在同一只动物内部进行，将不同成像平面上的数据汇总或比较同一动物的肿瘤邻近半球和対侧半球在不同时间点的变化；由于样本数量N=3，因此没有进行动物间的汇总测试。除非另有说明，否则使用双尾独立样本t检验进行比较。结果以平均值加减标准误差（s.e.m.）的形式报告，显著性阈值设为?p < 0.05，更严格的阈值分别为?p <= 0.05、p <= 0.01和???p <= 0.001。统计参数（包括使用的统计检验、n的确切值、n代表的含义以及离散度和精确度指标）在相应的图表注释和表S1及S2中报告。除非另有说明，n指的是单只动物内分析的成像平面数量，每个绘制分布的中心是平均值。统计分析在MATLAB（MathWorks）和Prism（GraphPad）中完成。由于样本数量较少，因此假设数据呈正态分布且方差相等，但没有进行正式检验；因此t检验结果应被视为观察到的差异的描述性总结，而不是严格的推断性检验。不同成像平面之间的比较被视为非配对比较，因为每个平面采样的是不同的解剖位置，分析比较的是半球或时间点，而不是跟踪单个体素；各次扫描之间没有强加配对结构。

为了量化肿瘤随时间的变化，我们分析了植入后第5天、第8天和第11天表达GV的细胞的非线性振幅调制信号。首先通过最大值对图像进行归一化，如果体素的强度超过平均值2.58个标准差（Z分数>2.58，p < 0.01），则将其分类为肿瘤阳性。由于阈值化的体素并不总是形成连续的质量，我们通过计算阳性体素周围的α形状并栅格化封闭体积（MATLAB alphaShape, inShape）生成了一个连续的肿瘤掩模，这样可以桥接小间隙同时保持非凸形态。通过将阳性体素的数量转换为物理单位（mm2）来量化每个成像平面上的肿瘤面积，这一过程在所有冠状平面上重复进行，并报告了每天各平面的平均肿瘤面积及其标准误差。

我们使用Matlab（MathWorks）从每个体素的时间信号与刺激模式之间的标准化相关性（皮尔逊积矩）单独计算了相关图谱，选择了z > 3.1的显著性水平（单尾检验，p < 0.001，对应的r > 0.193）。这使我们能够评估每个体素的血流动力学响应与刺激结构之间的统计显著性。对于所有扫描的冠状平面，我们识别出在视觉刺激期间激活的外侧膝状核内的体素。激活区域是在每次成像会话中独立重新计算的，而不是从前一会的固定基线掩模继承的；因此，超过阈值的体素数量随时间和半球而变化，响应区域的大小和形状也有所不同。

为了评估视觉诱发的反应随时间的变化，我们从激活的外侧膝状核提取的标准化血流动力学时间过程计算了激活与基线的比率（ABR）。对于每只小鼠和每个成像日（基线1、基线2、第5天、第8天和第11天），时间过程被归一化为z分数，并将其分组到一个矩阵中。对于每个会话，ABR计算为刺激期间的平均信号与基线期间的平均信号之差，然后除以基线信号的标准差，并在所有超过阈值的体素上取平均值。由于ABR是每个体素的平均值，因此它按区域大小进行了归一化，这样激活体素数量的变化不会单独改变ABR；因此该指标反映了激活区域内的平均响应幅度，而不是其空间范围。ABR是针对每个成像平面独立计算的，然后将各平面的值汇总以计算每个时间点的平均值和标准误差。

我们进行了基于光流位移的分析，以量化肿瘤随时间对外侧膝状核和脑微血管的变形。按照Afrashteh等人的STAR方法调整后，将五个时间点（基线1、基线2、第5天、第8天和第11天）的激活图（用于LGN）或ULM图（用于微血管）堆叠成一个3D数组。为了分析空间位移模式，我们在MATLAB中应用了Farneback密集光流算法（opticalFlowFarneback）。在基线参考时间和每个后续时间点之间计算了光流场，得到表示随时间变化的像素级运动向量。为了可视化，将光流场以矢量图的形式叠加在相应的ULM图上。每个ULM图都进行了强度归一化（立方根变换以压缩动态范围），并以灰度显示。流动向量使用[80 80]的抽取因子进行绘制，以减少视觉杂乱，并使用10的缩放因子提高可见性，从而定性表示组织变形的大小和方向。

我们使用既定的分析方法处理功能性连接记录。首先通过对多普勒信号进行阈值处理（选择中位数的正负10%）， removing运动伪影；然后只保留形成连续30秒周期的帧，以避免片段化或短暂的单独周期。接着应用0.3 Hz的低通滤波器去除高频信号，同时保留静息状态频带。使用4阶多项式拟合去除低频波动。然后使用5 x 5像素的平均滤波器对每个切片进行空间平滑，以减少高频空间噪声。最后对数据进行了奇异值分解。由于第一个空间特征向量与整个大脑组织相关，因此系统地将其去除。尽管这种全局信号回归可能导致结构之间的反相关值难以解释，但更倾向于采用这种方法，以避免任何可能影响整个大脑组织并引起人为强相关性的残余全局运动信号。

为了构建功能性连接矩阵[M]，我们使用了从Paxinos图谱定义的N个不同兴趣区域提取的CBV信号的时间过程。然后确定了每个过滤后的ROI信号之间的皮尔逊相关性，并在N x N矩阵上报告相关系数，其中cell Mi,j表示区域i和区域j之间的相关系数。ROI包括皮层、胼胝体、海马体、丘脑和下丘脑，这些区域在肿瘤最大显现的冠状平面上绘制，可以同时捕获多个脑结构。从这些矩阵中我们得出了两个总结指标。同源连接指数是通过计算每只动物左右同名ROI对之间的平均相关性得出的；它量化了半球间的协调强度，因为肿瘤是单侧的，因此作为侧向网络对称性的一个紧凑指标。全局平均连接性是通过计算连接矩阵所有非对角线元素的平均值得出的，提供了整个会话的整体连接强度测量。这两个指标都是按动物和时间点计算的，两个基线会话的平均值合并为一个基线值，除非分别显示两个基线。基于种子的映射是从从小操作子定义的种子ROI提取的CBV时间过程与大脑其他所有像素信号之间的皮尔逊相关性计算得出的。

为了量化局部血管特性，我们从超高分辨率的ULM数据中分析了单个微泡轨迹。轨迹指标仅针对小鼠1进行计算。在小鼠2中，第5天和第8天颅窗下积聚的空气影响了微泡的定位，因此排除了这些会话的数据；小鼠2和3的ULM轨迹指标没有报告。感兴趣的区域是使用功率多普勒图像手动在肿瘤周围区域和匹配的对侧脑区上绘制的。只有与每个ROI相交的轨迹被纳入分析。对于每个包含的轨迹，我们计算了四个指标：（1）轴向速度，即ULM跟踪报告的沿轨迹的平均（深度方向）速度；（2）轨迹长度，即轨迹起点和终点之间的直线距离；（3）迂曲度，计算为总路径长度与轨迹端点之间直线距离的比率，反映了偏离线性的程度；（4）微泡密度，估计为与ROI相交的轨迹数量除以ROI面积，作为局部灌注的代理。这种分析分别针对每个成像会话中的肿瘤周围区域和对侧ROI进行。对于每个包含的轨迹，我们计算了四个指标。