宫腔内富血小板血浆输注后子宫内膜免疫重塑模式与基线巨噬细胞丰度的关联：一项前瞻性配对样本研究

《Immuno》：Patterns of Endometrial Immune Remodeling Following Intrauterine Platelet-Rich Plasma Administration Are Associated with Baseline Macrophage Abundance

　　

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）已成为改善子宫内膜容受性的再生疗法，但其对子宫内膜免疫微环境的影响仍知之甚少。这项前瞻性配对样本研究调查了在着床窗期（window of implantation）宫腔内输注PRP后子宫内膜免疫微环境的变化。27名接受辅助生殖治疗的女性在PRP输注前后提供了配对子宫内膜活检样本。研究人员通过免疫组织化学（immunohistochemistry）和数字图像分析对基质中的CD3+ T淋巴细胞、CD4+ T辅助淋巴细胞、CD56+自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）和CD68+巨噬细胞进行了定量分析。PRP输注后，CD3+、CD4+、CD56+或CD68+细胞丰度均未观察到显著的整体变化（所有p > 0.05）。然而，对个体配对变化轨迹的探索性分析显示，77.8%的患者符合研究特定的协调性免疫重塑模式标准，该标准定义为四种分析免疫细胞群体中至少三种出现一致性的增加或减少。协调性增加模式患者的基线CD68+巨噬细胞丰度低于协调性减少模式患者，标准化效应量较大（Hedges' g = 1.28），且具有名义统计学显著性（p = 0.04）。然而，该关联在错误发现率（false discovery rate，FDR）校正后不再显著（q = 0.165）。这些发现表明，宫腔内PRP输注后子宫内膜免疫细胞变化存在异质性、患者特异性的模式，并提示基线巨噬细胞丰度可能是与后续免疫重塑模式相关的候选因素。协调性重塑分类及其与基线巨噬细胞丰度的关联应被视为探索性和假设生成性的结果。

论文解读：宫腔内富血小板血浆输注后子宫内膜免疫重塑模式及其与基线巨噬细胞丰度的关联

一、研究背景与目的

成功的胚胎着床依赖于容受性子宫内膜的建立，这需要胚胎与母体子宫内膜免疫微环境之间紧密协调的相互作用。子宫内膜免疫微环境由多种免疫细胞群体组成，其中T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞被认为是建立子宫内膜容受性的主要免疫细胞群体。既往研究提示，单独评估某一免疫细胞群体可能无法全面反映子宫内膜免疫微环境的复杂性，而不同免疫细胞亚群之间的协调互动和功能平衡可能更能代表子宫内膜免疫状态。研究人员的前期工作已证明，反映CD3⁺ T淋巴细胞、CD4⁺ T辅助淋巴细胞、CD56⁺ NK细胞和CD68⁺巨噬细胞之间平衡的免疫细胞比值与子宫内膜容受性和着床成功显著相关，且部分免疫细胞比值对着床结局的关联强度优于相应的单个免疫细胞群体。这为探索能够调节子宫内膜免疫微环境协调组织的治疗方法提供了理论依据。

富血小板血浆（PRP）因其富含生长因子、细胞因子、趋化因子及其他生物活性分子，已成为生殖医学中具有前景的再生疗法。在妇科领域，宫腔内PRP输注被越来越多地研究作为改善子宫内膜厚度、容受性和着床结局的策略，尤其是针对反复着床失败或薄型子宫内膜的女性。尽管多项临床研究报道了PRP治疗后令人鼓舞的生殖结局，但其发挥作用的生物学机制仍未完全阐明。现有研究多聚焦于临床妊娠结局或子宫内膜厚度，而对局部子宫内膜免疫微环境及其对PRP输注的应答关注不足。特别是，宫腔内PRP输注后是否会引起多种免疫细胞群体的协调性变化，而非单个免疫细胞亚群的孤立改变，目前尚不清楚。

基于上述考虑，本研究旨在表征着床窗期宫腔内PRP输注后子宫内膜免疫微环境的变化，具体评估四种主要基质免疫细胞群体（CD3⁺ T淋巴细胞、CD4⁺ T辅助淋巴细胞、CD56⁺ NK细胞和CD68⁺巨噬细胞）的变化，评估协调性免疫重塑模式，并检验基线免疫细胞丰度是否与后续免疫重塑模式相关。

二、研究设计与主要技术方法

本研究为前瞻性配对样本研究，纳入27名因非子宫内膜因素不孕指征接受辅助生殖技术（ART）治疗的女性，在自然月经周期的着床窗期（LH+7）于PRP输注前后各采集一次子宫内膜活检，共获得54份活检样本。研究排除了患有子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫内膜增生、恶性肿瘤、急性生殖道感染、慢性子宫内膜炎、近期抗生素治疗或需要治疗的临床相关子宫内膜微生物失调的女性。作为研究筛选程序的一部分，治疗前活检样本进行了16S rRNA基因扩增子测序的微生物组评估，微生物组数据仅用于患者筛选，未纳入后续分析。所有患者签署书面知情同意书，研究经Nadezhda妇女健康医院伦理委员会批准。

PRP制备采用标准化两步离心方案：从22 mL外周静脉血中，经500×g离心5分钟后转移血浆组分，再以700×g离心7分钟，将所得血小板沉淀重悬于自体血浆中，最终获得1.5 mL PRP。最终PRP制剂的平均血小板浓度为1122 × 10⁹/L，较外周血平均富集6.1倍。新鲜制备的PRP在LH+2时通过ELLIOCATH S导管立即注入宫腔，未使用外源性血小板激活剂。

免疫组化染色采用自动化Leica BOND系统，对四种免疫细胞群体进行检测：CD3⁺ T淋巴细胞（抗CD3）、CD4⁺ T辅助淋巴细胞（抗CD4）、CD56⁺ NK细胞（抗CD56）和CD68⁺巨噬细胞（抗CD68），并以CD138免疫组化评估浆细胞浸润以排除慢性子宫内膜炎。定量分析使用HALO图像分析软件CytoNuclear模块，仅纳入基质免疫细胞，排除腔上皮、腺上皮、子宫内膜腺体及组织伪影。结果以阳性染色基质免疫细胞占总基质细胞计数的百分比表示。此外还评估了四种免疫细胞比值（NK/T、Th/T、MΦ/T和Th/MΦ）。

统计分析使用SPSS 23.0和R 4.4.2。配对比较采用配对Student's t检验，独立亚组比较采用Welch独立样本t检验，标准化效应量以Hedges' g计算。协调性免疫重塑模式的分类依据四种免疫细胞群体变化方向的一致性，定义为至少三种免疫细胞群体出现一致性增加或减少。采用Spearman秩相关分析基线免疫细胞丰度与免疫重塑的关联，并应用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）校正。此外还进行了敏感性功效分析和多种阈值敏感性分析及置换检验。

三、主要研究结果

3.1 基线特征与微生物组筛选

研究纳入27名接受辅助生殖治疗的女性，共获得54份配对子宫内膜活检样本。参与者平均年龄40.5 ± 5.1岁，平均体质指数（BMI）24.2 ± 4.7 kg/m²，配对活检平均间隔27 ± 3.2天。所有纳入患者均未显示临床显著的微生物失调或沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、粪肠球菌或大肠埃希菌等病原体存在，且所有活检标本经CD138免疫组化评估均无慢性子宫内膜炎的组织病理学证据。

3.2 PRP输注后子宫内膜免疫细胞群体的变化

定量分析显示，宫腔内PRP输注后，四种分析免疫细胞群体的整体丰度均无显著变化。配对比较治疗前后活检显示，CD3⁺ T淋巴细胞（6.49 ± 2.05% vs. 4.47 ± 0.40%）、CD4⁺ T辅助淋巴细胞（1.86 ± 0.77% vs. 1.26 ± 0.18%）、CD56⁺ NK细胞（3.06 ± 0.42% vs. 3.63 ± 0.49%）和CD68⁺巨噬细胞（3.12 ± 0.33% vs. 3.15 ± 0.34%）均无统计学显著差异（所有p > 0.05）。四种免疫细胞比值（NK/T、Th/T、MΦ/T和Th/MΦ）在PRP输注后同样无显著变化（所有p > 0.05，所有q > 0.05）。尽管缺乏显著的组间差异，但个体间存在显著变异性，表明PRP输注后存在异质性的变化模式。敏感性功效分析显示，研究有80%的效能检测到Cohen's d ≥ 0.56的配对标准化效应量，而所有观察到的效应量均较小（?0.20至0.22）。

3.3 PRP输注后的个体免疫重塑模式

基于探索性方向分类，患者被分为三种免疫重塑模式：协调性增加、协调性减少和混合应答。13名患者（48.1%）表现为协调性增加模式，8名（29.6%）表现为协调性减少模式，6名（22.2%）表现为混合免疫重塑模式。三组在年龄、BMI、既往体外受精（IVF）周期数、既往胚胎移植次数、既往着床失败次数或配对活检间隔方面均无显著差异（所有p > 0.05）。

敏感性分析显示，随着最小变化阈值的增加，被分类为协调性重塑的患者比例从原始方向分析的77.8%下降至相对阈值5%、10%和20%时的70.4%、59.3%和51.9%；使用绝对阈值0.10、0.25和0.50个百分点时，相应频率分别为70.4%、48.1%和44.4%。在所有敏感性场景中，观察到的协调性重塑频率均高于置换零模型下的预期频率，但统计学证据因阈值而异。原始方向分类中，观察到的协调性重塑频率为77.8%，平均零预期为63.0%（置换p = 0.078）；使用0.10个百分点绝对阈值时，70.4%的患者表现出协调性重塑，零预期为53.7%（置换p = 0.042）。

3.4 基线CD68⁺巨噬细胞丰度与PRP输注后免疫重塑的关联

在四种评估的免疫细胞群体中，基线CD68⁺巨噬细胞丰度表现出最大的组间效应。协调性增加模式患者的基线CD68⁺巨噬细胞丰度低于协调性减少模式患者（2.42 ± 0.63% vs. 4.19 ± 2.04%），该差异经Welch's t检验具有名义显著性（p = 0.04），伴随较大的标准化效应量（Hedges' g = 1.28），但经Benjamini–Hochberg FDR校正后不再显著（q = 0.17）。基线CD3⁺、CD4⁺和CD56⁺细胞百分比在FDR校正后均无显著组间差异。

3.5 基线CD68⁺巨噬细胞丰度与PRP输注后免疫重塑程度的关系

基线CD68⁺巨噬细胞丰度与相对复合免疫重塑指数呈负相关（Spearman ρ = ?0.496，p = 0.0086，FDR校正q = 0.0179）。排除CD68⁺巨噬细胞后重新计算的指数仍保持基本不变的负相关（ρ = ?0.493，p = 0.0089，q = 0.0179）。然而，当使用绝对百分点变化量化免疫重塑时，该负相关未被重现，基线CD68⁺巨噬细胞丰度与包含全部四种标志物的绝对复合重塑指数呈正相关但不显著（ρ = 0.352，p = 0.0715，q = 0.0715），与排除CD68⁺巨噬细胞的相应指数亦呈正相关但不显著（ρ = 0.379，p = 0.0511，q = 0.0682）。基线调整线性模型未识别基线CD68⁺巨噬细胞丰度为与治疗后CD3⁺、CD4⁺或CD56⁺丰度独立相关的因素（所有FDR校正q > 0.05）。标志物特异性分析中，基于相对变化的分析初步提示基线CD68⁺巨噬细胞丰度与相对CD56⁺ NK细胞变化呈负相关，但该关联在分析有符号绝对百分点变化时未被重现，且无一标志物特异性关联达到名义显著性或FDR校正后显著性。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本探索性非对照配对前后研究中，宫腔内PRP输注后未观察到统一的组水平免疫细胞变化，而是识别出异质性的个体变化模式。尽管四种免疫细胞群体在组水平无显著差异，但超过四分之三的患者（77.8%）符合协调性免疫重塑的探索性标准。然而，主要方向分类的协调性频率未显著超过置换零模型预期（p = 0.078），强调该分类的描述性和假设生成性质。基线CD68⁺巨噬细胞丰度在协调性增加与减少模式患者间表现出最大的组间效应，名义显著且效应量大，但FDR校正后不显著，应视为假设生成性发现。相对复合重塑指数与基线巨噬细胞丰度的负相关在排除CD68⁺后仍保持显著，但未在使用绝对变化量化时重现，表明该关系依赖于变化量化方式，可能部分反映相对变化指标对基线值的数学依赖性。巨噬细胞因其在组织稳态、修复、再生和免疫调节中的关键协调作用，被视为生物学上合理的候选调节因素，但本研究无法确立因果关系。研究还强调了整合多免疫细胞群体变化评估的重要性，与前期工作中免疫细胞比值对着床结局关联更强的结果一致。子宫内膜微生物组筛选有助于减少微生物失调对局部免疫细胞组成的潜在混杂影响。研究局限性包括非对照设计、样本量有限、未评估生殖结局、免疫组化仅限于四种主要免疫细胞群体、协调性分类为探索性、PRP分子组成未表征、仅进行治疗前微生物组分析以及单一治疗后时间点评估。

结论：这项配对前后研究识别了宫腔内PRP输注后子宫内膜免疫细胞变化的异质性且常为协调性的模式，尽管单个免疫细胞群体无显著组水平变化。虽然T淋巴细胞、T辅助淋巴细胞、NK细胞或巨噬细胞丰度无显著组间差异，但大多数患者符合涉及多种免疫细胞群体的协调性免疫重塑探索性标准。然而，主要方向分类的频率未显著超过置换零模型预期（p = 0.078），强调了该探索性分类的描述性和假设生成性质。基线巨噬细胞丰度作为与协调性免疫重塑模式相关的候选因素出现，但组间关联在多重检验校正后不再显著。这些探索性发现提示，子宫内膜预先存在的免疫组织可能有助于PRP输注后免疫重塑模式的个体间变异，值得在更大的独立队列中验证。未来整合生殖结局评估、功能性免疫分析、巨噬细胞表型鉴定、PRP分子表征和单细胞方法的研究，对于验证这些免疫重塑模式的临床相关性及阐明再生疗法个体化应答的机制十分必要。