缢蛏原代贴壁外套膜细胞中棕榈酸诱导脂滴积累的转录组响应

《Fishes》：Transcriptional Response to Palmitic Acid-Induced Lipid Droplet Accumulation in Primary Adherent Mantle Cells of Sinonovacula constricta (Lamarck 1818)

　　

棕榈酸（palmitic acid, PA）是海洋双壳类动物饮食中最丰富的饱和脂肪酸，但其细胞调控机制仍不清楚。研究人员利用缢蛏（Sinonovacula constricta）的原代贴壁外套膜细胞，检测了PA诱导的脂滴（lipid droplet, LD）积累及其潜在的转录组响应。研究人员确定，添加10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的L-15培养基提供了最佳培养条件。油红O（Oil Red O, ORO）染色表明，PA以剂量依赖性方式触发LD含量增加，在50 μM时即可观察到显著沉积。转录组分析揭示了885个差异表达基因（477个上调，408个下调），主要富集于脂质代谢（如过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR和甘油磷脂途径）、内质网应激反应（如蛋白质加工和自噬）以及细胞骨架组织。PA处理与PLIN2、SCD和HMGCS1的上调以及脂肪酸氧化基因FABP3的下调相关，提示转录向脂质储存转变并减少脂肪酸氧化。同时，PA可能激活内质网应激反应，HSPA5、EIF2AK3和DNAJC3的显著诱导表明了这一点。研究结果提供了双壳类动物中PA与LD积累相关的细胞证据，可能通过脂质代谢和内质网应激通路的整合转录变化实现，为缢蛏养殖的营养调控策略提供了参考。然而，这些转录变化与功能结果之间的因果关系需要通过蛋白质水平和体内研究进一步验证。

海洋双壳类（marine bivalves）包括牡蛎、蛤、贻贝和扇贝等，是全球水产养殖的重要类群，对粮食安全和沿海经济具有重要贡献。双壳类作为滤食生物，其脂肪酸组成直接反映饵料微藻的脂肪酸构成。棕榈酸（palmitic acid, PA）是自然界最丰富的饱和脂肪酸，也是微藻中含量最高的脂肪酸。在哺乳动物中，过量PA可诱导内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激、抑制自噬并激活炎症反应；在鱼类中也有类似报道。然而，PA在海洋双壳类中的细胞调控机制仍不清楚。缢蛏（Sinonovacula constricta）是中国重要的经济双壳类，研究人员前期已建立其原代贴壁外套膜细胞培养体系并用于二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）代谢研究，但培养基优化和PA的代谢机制尚未被阐明。因此，本研究旨在优化缢蛏原代贴壁外套膜细胞的培养条件，通过不同浓度PA处理观察脂滴（lipid droplet, LD）积累，并利用转录组测序解析PA调控的分子通路。

研究人员首先比较了三种商品化培养基（L-15、M199和MEM）及不同胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）浓度对原代贴壁外套膜细胞贴壁和形态的影响。随后制备PA-牛血清白蛋白复合物，以不同浓度（10–400 μM）处理细胞，采用油红O（Oil Red O, ORO）染色定量脂滴积累。基于剂量效应结果，选取50 μM PA处理6小时进行Illumina HiSeq转录组测序。测序数据经质控、比对到缢蛏参考基因组（GCA_007844125.1），以|Log₂FC|≥1和FDR<0.05为标准鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并进行GO和KEGG富集分析。每个生物重复来自不同批次缢蛏，每重复取6只成年缢蛏外套膜组织混合培养，共3个生物重复。

3.1 基础培养基和FBS浓度的优化
在三种基础培养基中，L-15在12小时和24小时均能更好地支持细胞贴壁和铺展，细胞形态正常；而M199和MEM中细胞呈圆形且易脱落。FBS浓度测试显示，10% FBS的细胞附着率和形态维持最佳；0%和5% FBS导致贴壁不足，15% FBS则引起细胞异常聚集和胞质空泡化。因此，确定含10% FBS的L-15培养基为最优培养条件。

3.2 PA处理下原代贴壁外套膜细胞LD积累特征
ORO染色显示，对照组无明显脂滴，而50–400 μM PA处理组均出现不同程度的脂滴积累，且随浓度升高而增加，50 μM即达到显著水平。在10–50 μM浓度梯度中，10 μM PA即可诱导可检测的脂滴形成，定量分析显示各处理组ORO阳性面积百分比均显著高于对照组，且呈浓度依赖性。基于此，选择50 μM PA进行后续转录组实验。

3.3 转录组测序数据特征
每个样本获得40,536,588至43,277,126条clean reads，clean reads比率达99.63%以上，Q30为96.75%–96.90%，GC含量为40.40%–40.94%。clean reads比对到缢蛏参考基因组的效率为75.09%–76.87%，表明测序数据质量可靠。原始数据已提交至NCBI SRA（登录号PRJNA1465600）。

3.4 DEGs特征
主成分分析显示PA处理组与对照组沿第一主成分明显分离，PC1解释93.46%的方差，表明PA处理引起基因表达的广泛重编程。共鉴定出885个DEGs，其中477个上调、408个下调。上调最显著的基因包括多个热休克蛋白（HSPA5、HSP70B2、HSP23等）、内质网伴侣与UPR调节因子（SIL1、ERO1B、DNAJC22），以及脂代谢相关基因（PLA2G12A、PLIN2）和自噬受体SQSTM1。下调最显著的基因涉及细胞骨架和细胞黏附（UNC-89、NPHS1、CTNNA1、TAGLN3），以及溶质载体转运蛋白SLC6A12、DNA损伤修复基因BRCA1等。

3.5 DEGs的GO富集分析特征
GO富集分析显示，生物过程类别中显著富集16个二级条目，前三位为细胞过程、单一生物过程和代谢过程；分子功能类别中结合、催化活性和分子功能调节活性富集最显著；细胞组分中细胞和细胞组分条目富集最显著。结果提示PA触发了涉及基本细胞活动、代谢重编程和结构组织的广泛转录应答。

3.6 DEGs的KEGG富集分析特征
KEGG通路富集分析将DEGs归属到6个A类和43个B类功能分类。前20条显著富集通路可归纳为四类：第一类为内质网应激和蛋白质加工，包括内质网蛋白质加工、线粒体自噬和自噬；第二类为脂质代谢相关通路，包括PPAR信号通路、类固醇激素生物合成、甘油磷脂代谢和脂质与动脉粥样硬化；第三类为多种信号通路，如MAPK、催乳素、雌激素、B细胞受体和长寿调控通路；第四类包括氨酰-tRNA生物合成、磷酸戊糖途径、抗原加工与呈递以及若干疾病通路。

讨论部分指出，L-15培养基和10% FBS是缢蛏原代贴壁外套膜细胞培养的适宜条件，与多种双壳类细胞培养研究一致。PA诱导的脂滴积累具有浓度依赖性，即使10 μM也能产生可检测的脂滴，表明缢蛏外套膜细胞对PA的摄取和酯化效率较高。转录组数据显示，PA处理与脂质代谢重编程相关：PLIN2（脂滴表面结构蛋白）、SCD（硬脂酰辅酶A去饱和酶）和HMGCS1（胆固醇合成限速酶）上调，而脂肪酸氧化相关基因FABP3下调，提示转录水平向脂质储存偏移。同时，HSPA5（GRP78/BiP）等内质网应激标志基因显著上调，EIF2AK3（PERK）及其负调节因子DNAJC3同步上调，以及自噬通路富集，提示PA可能激活内质网应激反应并启动蛋白质稳态维持机制。与前期DHA研究相比，PA和DHA均诱导脂滴积累，但转录程序不同：DHA富集免疫相关通路，而PA富集内质网应激和自噬通路，表明两者在双壳类细胞中具有不同的营养调控作用。

研究结论：本研究建立了缢蛏原代贴壁外套膜细胞培养系统，优化了培养条件（90%基础培养基MBSS:L-15=7:3 + 10% FBS）。PA处理以浓度依赖性方式增加脂滴积累。转录组分析显示，PA暴露与脂质合成基因（PLIN2、SCD、HMGCS1）上调和脂肪酸氧化基因FABP3下调相关，同时与内质网应激相关转录特征（HSPA5、EIF2AK3、ERO1B、SQSTM1上调及自噬通路富集）相关。这些发现提示PA诱导的脂质积累可能涉及脂质代谢和内质网应激的协调调控，为理解双壳类脂肪酸代谢提供了细胞基础，也为缢蛏养殖营养调控策略提供了参考。然而，这些通路在整体动物水平上的因果关系和功能意义仍需通过后续功能验证和体内研究加以确定。