氯氮平在精神分裂症相关神经发育模型中对PV中间神经元、周神经网及行为的性别依赖性效应

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Sex-dependent effects of clozapine on PV interneurons, PNNs, and behavior in a neurodevelopmental model with schizophrenia-relevant phenotypes

　　

氯氮平（clozapine, CLZ）在具有精神分裂症相关表型的神经发育模型中对PV中间神经元、周神经网（perineuronal nets, PNNs）及行为的影响具有性别依赖性。氯氮平在精神分裂症样神经发育模型中诱导PV中间神经元和PNNs发生性别依赖性变化。雄性和雌性小鼠对氯氮平治疗表现出不同的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关转录响应。氯氮平对雄性和雌性的社会记忆和认知灵活性具有差异性调节作用。性别依赖性的ECM相关改变可能构成精神分裂症中对氯氮平异质性反应的潜在基础。

本研究系统探讨了氯氮平（clozapine, CLZ）在具有精神分裂症（schizophrenia, SCZ）相关表型的神经发育模型中对PV中间神经元、周神经网（perineuronal nets, PNNs）及行为的性别依赖性效应。SCZ是一种复杂的神经发育障碍，其发病年龄、症状特征、疾病进展及治疗反应均存在显著性别差异，但既往基础与临床研究多倾向于以雄性为中心，导致对性别依赖性神经机制的认识不足。PV中间神经元及其周围的PNNs是维持皮层兴奋/抑制平衡的关键结构，其异常在SCZ中已被广泛报道，且细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关通路可能受到性别激素的调节。CLZ作为治疗难治性SCZ的金标准药物，其对ECM和PV-PNN回路的作用机制尚不明确，尤其在性别差异方面几乎空白。基于此，研究人员利用围产期氯胺酮（ketamine, KET）暴露的神经发育小鼠模型（该模型模拟早期NMDA受体功能低下及SCZ相关表型），采用性别分层设计，结合组织学、转录组学和行为学分析，系统考察了CLZ在雌雄个体中的差异化效应。研究共使用111只C57BL/6J小鼠，分为对照组（CO）和KET组，成年后分别给予赋形剂（VEH）或CLZ治疗8周，行为测试于治疗4周后进行。结果显示：KET暴露在两种性别中均显著降低内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）中PV+细胞密度、PNN密度及PV+WFA+细胞密度；但CLZ的治疗效应呈性别分化——在雄性中恢复PNN密度，而在雌性中仅恢复PV+WFA+密度。ECM相关基因表达方面，KET导致雌性中Adamts2、Tnr上调和Reelin下调，雄性仅Acan上调；CLZ部分逆转这些变化，并呈现性别特异模式：雌性中恢复Hapln2和Reelin，雄性中恢复Acan并上调Hapln2和Reelin。行为学上，CLZ仅改善雄性KET小鼠的社会记忆障碍，而对雌性无效；但CLZ在两种性别中均能逆转KET诱导的认知灵活性缺陷。此外，CLZ引起体重下降，雄性效应更显著且持久。这些发现揭示了CLZ作用的高度性别依赖性和背景依赖性，提示性别依赖性ECM改变可能是CLZ临床异质性反应的候选神经生物学基础，强调在精神药理学研究中必须将性别作为关键生物学变量。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用围产期KET暴露（PND 7、9、11，30 mg/kg）构建神经发育模型，成年后CLZ（5 mg/kg）连续给药8周；通过免疫荧光和基于无偏体视学原理的细胞计数，定量mPFC中PV+中间神经元和WFA+标记的PNN密度；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测ECM相关基因（Acan、Adamts2、Bcan、Hapln2、Mmp2、Mmp9、Reln、Tnr）的表达；采用三箱社交测试、五试社会记忆测试和改良Morris水迷宫（MWM）分别评估社交性、社会记忆、空间学习记忆和认知灵活性；体重在全程监测。共111只小鼠，分三个独立队列用于行为、神经形态和分子分析。

**3.1 CLZ对PV中间神经元和PNNs的性别依赖性调节**
通过免疫荧光和体视学定量分析发现，KET暴露在雌性和雄性mPFC中均显著降低PV+细胞密度、PNN密度和PV+WFA+密度。CLZ治疗在雄性KET小鼠中恢复PNN密度，而在雌性KET小鼠中仅增加PV+WFA+密度，表明对PV-PNN关联的修复存在性别特异性。

**3.2 CLZ对ECM相关基因表达的性别依赖性影响**
RT-qPCR结果显示，KET诱导雌性小鼠中Adamts2、Tnr上调和Reelin下调，而雄性仅Acan上调。CLZ治疗在雌性中恢复Hapln2和Reelin表达，在雄性中恢复Acan并上调Hapln2和Reelin。Mmp2和Mmp9在各组中无显著变化，提示效应具有选择性。

**3.3 CLZ对社会行为的性别依赖性影响**
三箱测试和五试社会记忆测试显示，KET破坏了两性小鼠的社交性和社会记忆。CLZ仅在雄性KET小鼠中恢复社会记忆偏好，对雌性无效。此外，CLZ在对照雌性中降低社交兴趣，在对照雄性中也损害社会记忆，表明其不良效应同样具有性别差异。

**3.4 CLZ对认知灵活性和空间记忆的性别依赖性影响**
改良MWM测试表明，KET选择性损害两性小鼠的逆转学习能力，CLZ治疗可逆转这一缺陷，且效应在雌雄中一致。然而，在对照动物中，CLZ反而损害认知灵活性，并降低对训练象限的偏好，且雌性对CLZ诱导的损伤更为敏感，而感觉运动能力和动机不受影响。

**3.5 CLZ对体重的性别依赖性影响**
围产期KET暴露对成年期体重无长期影响。CLZ治疗在两个性别中均降低KET小鼠体重，但雄性体重下降更显著且持续时间更长。此外，CLZ诱导对照雄性体重进行性下降，而对照雌性无此效应，提示CLZ的代谢效应存在性别二态性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，KET暴露导致的PV和PNN减少在两性中相似，但CLZ的修复作用呈性别分化，这可能与雌激素受体β（ERβ）在mPFC中的分布及青春期PNN形成的性别差异有关。CLZ可能通过性别依赖性CYP1A2代谢差异影响药物暴露，但本研究未检测血药浓度，此机制尚属推测。CLZ对社交认知和认知灵活性的分离效应可能反映不同神经回路对PNN恢复程度的需求差异。在对照动物中CLZ造成的行为损害提示其作用为背景依赖性，而非简单的改善性干预。研究者强调，本研究为描述性研究，不能确立因果关系，且行为、组织学和分子数据来自独立队列，无法进行个体水平关联。结论是：生物性别是决定CLZ相关PNN、ECM通路和行为结局变化的关键因素，性别依赖性ECM改变可能构成CLZ反应的候选相关标志物，未来需在临床前研究中采用性别分层设计，并探索ECM改变与CLZ疗效间的因果机制。