《Biomedicine & Pharmacotherapy》：OSU-03012 mitigates pulmonary fibrosis by targeting ECM proteins via suppression of S6K-mediated translation and acceleration of MMP-driven clearance
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OSU-03012（OSU）可预防肺纤维化的发展，并诱导肺纤维化的治疗效应。OSU通过抑制S6K阻断细胞外基质（ECM）蛋白的从头翻译，同时通过激活ERK/JNK通路驱动基质金属蛋白酶（MMP）依赖性的ECM降解。在正常组织修复过程中，成纤维细胞分化为活化的肌
OSU-03012（OSU）可预防肺纤维化的发展，并诱导肺纤维化的治疗效应。OSU通过抑制S6K阻断细胞外基质（ECM）蛋白的从头翻译，同时通过激活ERK/JNK通路驱动基质金属蛋白酶（MMP）依赖性的ECM降解。在正常组织修复过程中，成纤维细胞分化为活化的肌成纤维细胞，通过产生胶原蛋白和纤连蛋白等ECM组分在伤口愈合中发挥关键作用。然而，在进展性间质性肺炎（尤其是特发性肺纤维化（IPF））中，这一生理修复机制失调，导致肌成纤维细胞异常增殖和持续活化，进而造成ECM过度沉积、肺泡结构不可逆破坏，最终引起肺功能严重下降和致死性呼吸衰竭。IPF预后极差，诊断后中位生存期约3–5年。目前标准药物疗法为吡非尼酮和尼达尼布，但现有疗法仅能延缓疾病进展，无法逆转已存在的纤维化病灶，且医疗费用高、不良事件发生率高。因此，亟需开发具有新机制、能主动诱导纤维化治疗效应的下一代抗纤维化药物。成纤维细胞-肌成纤维细胞转变（FMT）是肺纤维化发病的核心环节。要实现真正强效的抗纤维化治疗，不仅需抑制FMT并阻断新ECM产生，还需通过激活MMP等蛋白水解酶主动降解组织中已沉积的ECM。近期研究还揭示，肌成纤维细胞大量产生ECM高度依赖mTOR/S6K信号通路对mRNA转录和翻译的增强调控。研究人员曾报道塞来昔布及其衍生物2,5-二甲基塞来昔布（DMC）在心脏、皮肤、肾脏和肺等多器官中具有显著抗纤维化作用，其机制为抑制Akt信号通路。塞来昔布和DMC可非环氧化酶（COX）依赖性抑制磷酸肌醇依赖性激酶-1（PDK-1），从而抑制其直接下游底物Akt的磷酸化。OSU-03012（OSU）作为塞来昔布衍生物，最初被开发为强效PDK-1抑制剂，其抑制PDK-1的半抑制浓度（IC50）为5 μM，效力约为塞来昔布（IC50 = 48 μM）的十倍，且缺乏COX-2抑制活性，可规避传统COX抑制剂相关的胃肠道黏膜损伤和心血管并发症风险。然而，OSU对包括肺纤维化在内的纤维化疾病的疗效及分子机制尚不清楚。本研究采用博来霉素（BLM）诱导的小鼠模型和转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激的人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系，全面探究OSU抗肺纤维化的疗效及其分子机制。
论文解读：OSU-03012通过双重机制靶向细胞外基质缓解肺纤维化
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种进行性、致命性的间质性肺疾病，诊断后中位生存期仅约3–5年。其病理核心是成纤维细胞向肌成纤维细胞转变（fibroblast-to-myofibroblast transition, FMT）的失调，导致细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积和肺泡结构不可逆破坏。现有抗纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布虽能延缓用力肺活量下降速度，但无法逆转已形成的纤维化病灶，且存在胃肠道不良反应和肝功能异常等限制。因此，亟需开发兼具抑制ECM产生和促进ECM降解双重能力的新型抗纤维化药物。OSU-03012（OSU）是一种塞来昔布衍生物，最初作为强效磷酸肌醇依赖性激酶-1（phosphoinositide-dependent kinase-1, PDK-1）抑制剂被开发，其对PDK-1的半抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC50）为5 μM，效力约为塞来昔布的十倍，且缺乏环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）抑制活性。既往研究提示PDK-1/Akt/mTOR/S6K信号轴在肌成纤维细胞ECM合成中发挥关键调控作用，但OSU对肺纤维化的疗效及机制此前尚未明确。
研究人员利用博来霉素（bleomycin, BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）刺激的人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系，系统评估了OSU的预防性和治疗性抗纤维化作用，并解析其分子机制。预防性实验中，小鼠于第1天气管内滴注BLM（0.2 mg/kg），从第1–14天每日口服OSU（100 mg/kg/day），第14天通过三维微型计算机断层扫描（three-dimensional micro-computed tomography, 3D micro-CT）、Masson三色染色、Ashcroft评分、蛋白印迹、原位杂交和免疫组化评估纤维化程度。治疗性实验中，小鼠于第1天给予BLM，从第8–21天给药OSU，第21天进行评估。体外实验中，MRC-5细胞经TGF-β1（5 ng/mL）诱导FMT，同时或先后给予OSU（1–5 μM），采用蛋白印迹、免疫荧光、实时定量PCR、苦味酸天狼星红染色、小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲低S6K、药理学抑制剂（GM6001、PD0325901、SP600125、BX-795）等手段探究OSU对ECM合成与降解的调控机制。
研究结果显示：第一，OSU预防BLM诱导的小鼠肺纤维化。3D micro-CT显示BLM组肺部出现弥漫性磨玻璃影和实变，OSU处理后明显减轻；Masson染色和Ashcroft评分证实OSU显著降低胶原沉积；蛋白印迹显示OSU显著抑制BLM升高的I型胶原α1链（collagen type I alpha 1 chain, COL1A1）和纤连蛋白（fibronectin, FN1）表达；原位杂交和免疫组化显示OSU显著降低肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的表达。第二，OSU在MRC-5细胞中抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化。OSU显著降低ACTA2 mRNA和α-SMA蛋白水平，并抑制COL1A1、纤连蛋白和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）蛋白表达及胶原沉积，但对COL1A1、FN1和CTGF的mRNA水平无显著影响，提示OSU在翻译水平而非转录水平调控ECM蛋白。第三，OSU通过抑制S6K磷酸化阻断ECM蛋白翻译。TGF-β1增强S6K磷酸化，OSU可消除该效应；选择性PDK-1抑制剂BX-795同样抑制S6K磷酸化。S6K siRNA敲低虽不影响α-SMA蛋白，但显著阻断TGF-β1诱导的COL1A1和纤连蛋白积累，与OSU效应相似，证明OSU通过抑制S6K通路作为ECM翻译抑制剂发挥抗纤维化作用。第四，OSU经ERK/JNK通路上调MMP表达促进已沉积ECM降解。在TGF-β1预处理的细胞中，OSU可显著减少已形成的胶原沉积；蛋白印迹显示OSU上调胶原降解型基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-1和MMP-13、纤连蛋白降解型MMP-2和MMP-3，且不影响金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP）-1、-2和-3水平。广谱MMP抑制剂GM6001可逆转OSU的胶原降解作用。机制上，OSU显著增强细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）和c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）的磷酸化，联合使用ERK抑制剂PD0325901与JNK抑制剂SP600125完全消除OSU诱导的MMP升高，表明OSU通过激活ERK/JNK通路上调MMP表达。S6K敲低不影响MMP蛋白水平，说明MMP翻译不依赖S6K活性。第五，OSU对已建立的肺纤维化模型具有治疗作用。在BLM诱导第8–21天给药OSU可显著降低Ashcroft评分、抑制COL1A1和纤连蛋白表达，并伴随体内ERK和JNK磷酸化增强及MMP-1、-2、-3、-13表达上调。
讨论部分指出，OSU的抗纤维化作用基于双重机制：通过抑制S6K磷酸化阻断ECM蛋白翻译，同时通过激活ERK/JNK通路上调MMP促进ECM降解。虽然ERK和JNK在部分研究中被视为促纤维化信号，但OSU在激活该通路的同时抑制S6K轴，从而选择性促进MMP表达而不增加ECM产生。OSU作为PDK-1抑制剂，其抑制S6K磷酸化可能涉及PDK-1/S6K信号轴的调控，但本研究未直接验证PDK-1与S6K之间的因果关系。此外，OSU还存在不依赖PDK-1的药理作用（如活性氧产生、内质网应激和自噬诱导），这些机制在肺纤维化中的作用具有细胞类型依赖性，其相对贡献需进一步研究。研究局限性包括：单次气管内BLM模型不能完全模拟人类IPF的慢性进行性病程；治疗性给药自第8天开始，不能完全排除对纤维化进展的抑制而非纯粹逆转效应；体外实验仅使用MRC-5细胞系，需在IPF患者原代肺成纤维细胞中验证；OSU的人体药代动力学和安全性数据仍缺失。
结论部分：本研究表明，OSU通过双重机制靶向ECM蛋白，一方面经S6K通路抑制ECM产生的同时，另一方面经ERK/JNK通路加速MMP依赖性ECM消退，从而抑制肺纤维化进展并促进其消退。OSU同步阻断ECM生成并驱动活跃的组织重塑，是包括IPF在内的肺纤维化极具前景的治疗候选药物，其新机制克服了现有临床疗法仅能延缓进展而无法逆转纤维化的关键局限。
