贝莱斯芽孢杆菌DH18三重耦合机制：基因组潜力、代谢物多样性与微生物群落优化协同防控草莓镰刀菌根腐病并促进生长

《Microbiology Spectrum》：Triple-coupling of genomic potential, metabolite diversity, and microbial community optimization drives Bacillus velezensis DH18-mediated resistance to Fusarium root rot and growth promotion in strawberry

　　

摘要 由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的根腐病严重威胁草莓生产，亟需有效的防控策略。兼具抑制病害和促进植物生长的有益微生物提供了有前景的解决方案，但其多尺度机制仍知之甚少。本研究从受根腐病影响的草莓根际分离出一株兼具植物促生和抑病活性的双功能菌株——贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）DH18。该菌株对草莓根腐病表现出显著防效，盆栽和田间试验的防效分别达86.95%和89.49%。同时，该菌株显著促进草莓植株生长，并提高根际土壤和叶片中的养分含量。全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）揭示DH18携带大量与抗菌代谢产物合成相关的生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs），以及参与植物促生性状的基因。代谢物谱分析进一步鉴定出关键生物活性化合物，如表面活性素（surfactin）、水杨酸（salicylic acid）和柠檬酸（citric acid），这些化合物与病害抑制和生长促进相关。此外，微生物群落分析表明，施用DH18重塑了根际群落结构，富集了有益属（如芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas和被孢霉属Mortierella），同时抑制了植物病原菌镰刀菌属（Fusarium），从而有助于形成抑病型土壤环境。这些发现表明，贝莱斯芽孢杆菌DH18所赋予的病害抑制和植物生长促进作用与其基因组潜力、代谢物多样性及对土壤微生物群落的有益调控所构成的整合机制相关。本研究不仅将DH18定位为一种有前景的双功能生物接种剂，还为植物促生根际细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）介导益处的分子和生态基础提供了见解。 重要性 草莓生产面临镰刀菌根腐病的严峻挑战，该病害威胁作物产量和可持续性。化学防治常损害生态系统，凸显了对环境友好型替代方案的需求。本研究介绍了贝莱斯芽孢杆菌DH18，一种既能防治根腐病又能促进植物生长的有益细菌。田间试验表明，该菌株可使病害减少85%以上，并改善土壤健康。DH18通过多种途径发挥作用：产生表面活性素等天然化合物以抑制病原菌，富集土壤中有益微生物，以及改善养分吸收。这些发现为替代合成化学品提供了一种安全有效的解决方案，促进可持续农业。通过理解DH18如何整合基因组、代谢和微生物群落作用，本研究推进了生物接种剂在更健康作物和环境中的应用。

一、研究背景与意义

草莓（Fragaria × ananassa）是全球经济价值最高的栽培浆果之一，对农业经济贡献显著。然而，集约化生产系统极易遭受土传植物病原菌的侵袭，对可持续栽培构成重大挑战。其中，根腐病病原菌因其毁灭性影响和在主要草莓种植区的广泛流行而成为关键威胁。草莓根腐病表现为根系逐渐变黑和组织坏死，最终导致植株严重矮化和产量显著下降。统计分析表明，根腐病在全球主要草莓产区（包括北美、欧洲和亚洲）每年造成15%–30%的产量损失，严重发病田块的经济损失超过50%。草莓根腐病的病原学涉及多种真菌，其中镰刀菌属（Fusarium sp.）、腐霉属（Pythium sp.）和疫霉属（Phytophthora sp.）是主要病原菌，而镰刀菌属被鉴定为所有主要产区中最普遍、最具破坏性的草莓根腐病致病因子。

目前，化学杀菌剂是防治草莓根腐病的主要策略。然而，鉴于草莓是直接消费的农产品，且全球对农业可持续性的关注日益增强，依赖化学药剂已引发重大挑战，包括果实中农药残留积累、日益严格的监管限制，以及对生态环境和人类健康的潜在不利影响。因此，亟需开发更安全、更有效且环境友好的替代方案。生物防治制剂，特别是利用天然微生物资源的制剂，正成为实现草莓根腐病可持续管理的关键途径。

植物促生根际细菌（PGPR）是一类定殖于植物根际并提供生态效益的微生物，通过直接刺激植物发育和缓解生物及非生物胁迫等机制显著增强植物健康。在PGPR领域，研究最广泛和应用的微生物类群包括芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮螺菌属（Azospirillum）和链霉菌属（Streptomyces）。其中，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）因其广谱抗菌特性、强环境适应性和多样的生防及促生机制而成为特别有前景的菌株。当前研究已 delineated 贝莱斯芽孢杆菌的三大核心功能支柱：（i）对病原菌的直接拮抗；（ii）有效促进植物生长；（iii）触发植物系统性抗性。然而，尽管取得了这些进展，贝莱斯芽孢杆菌在病害防治和生长促进协同效应中的机制，包括功能基因调控、代谢物分泌和根际微生物群落重塑，仍未完全阐明。这一知识空白凸显了进一步探索以充分发挥PGPR在可持续农业中潜力的必要性。

近年来，高通量测序和质谱技术的进步使得对PGPR机制的跨尺度认知成为可能。全基因组测序结合功能注释、代谢组学分析和微生物扩增子测序等技术，为系统阐明PGPR的分子和生态基础提供了前所未有的分辨率。然而，当前关于PGPR作用机制的研究仍主要集中于单一组学层面的推测和孤立验证，忽视了"功能基因-代谢物-根际微生物组"的整体整合。因此，本研究旨在：（i）通过整合分子拮抗和生态调控探索PGPR实现协同抑病和促生的机制；（ii）在多尺度上表征PGPR-植物-土壤微生物组的相互作用；（iii）通过多组学分析揭示核心功能性状，为多功能微生物接种剂的开发提供高效菌株资源，促进可持续农业实践。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员从中国安徽省合肥市长丰草莓种植基地（117.27°E，31.85°N）采集的发病草莓植株根部，采用组织分离法分离出草莓根腐病病原真菌，经柯赫氏法则验证确认为尖孢镰刀菌FO-1。同时采用稀释平板法从感染根腐病的草莓根际土壤中分离根际细菌，通过对峙培养法筛选获得一株对尖孢镰刀菌具有最强拮抗活性的菌株DH18，经16S rRNA基因系统发育分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌株还表现出多种植物促生特性，包括溶磷（34.78 mg·L?1）、解钾（11.57 mg·L?1）、IAA生物合成（1.60 mg·L?1）和产铁载体能力。

研究采用的主要关键技术方法包括：（1）全基因组测序（WGS），采用Illumina NovaSeq 6000和PacBio Sequel II双平台测序，结合Canu、Racon、Circlator和Pilon进行组装和校正，通过Prodigal进行基因预测，并利用Nr、GO、KEGG、eggNOG和antiSMASH等数据库进行功能注释和次级代谢产物生物合成基因簇预测；（2）液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析非挥发性和挥发性代谢产物；（3）16S rRNA基因和ITS扩增子测序分析根际微生物群落结构变化；（4）盆栽和田间试验评估防病和促生效果。

三、主要研究结果

1. 拮抗微生物的分离与鉴定

研究人员从草莓根腐病发病植株根组织分离获得潜在病原真菌，经形态学观察、ITS区域分子鉴定和系统发育分析，鉴定为尖孢镰刀菌FO-1。通过标准化回接试验完成柯赫氏法则验证，确认FO-1为该生产系统中草莓根腐病的致病菌。从草莓根际土壤中筛选获得12株对尖孢镰刀菌具有拮抗活性的细菌分离物，其中菌株DH18表现出最强的体外拮抗能力，菌丝生长抑制率达54.36%。扫描电镜（SEM）观察显示，DH18处理后的病原菌菌丝出现细胞肿胀、表面皱缩和胞内成分泄漏等明显形态变化，表明细胞结构受到严重破坏。16S rRNA基因比对显示DH18与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株具有完全序列一致性，系统发育分析将其置于芽孢杆菌属内支持良好的分支。

2. 盆栽试验

在盆栽防病试验中，接种DH18的草莓植株表现出显著优于对照的生长状况，根系发达、叶片浓绿，仅出现轻微萎蔫或黄化。对照组发病率达73.33%，病情指数为51.11；而DH18接种组发病率显著降至20.00%（P < 0.001），病情指数降至6.67（P < 0.001），防效达86.95%。在盆栽促生试验中，接种DH18后第10天，植株株高增加32.37%，地上部干重增加34.15%，根系干重增加100.00%（P < 0.05）；地上部鲜重增加87.70%，根系鲜重增加126.67%（P < 0.01）；根长增加82.36%（P < 0.001）。第30天时，促生效果持续存在，地上部鲜重增加69.31%，根系鲜重增加125.45%（P < 0.001）。这些结果表明DH18菌株显著促进草莓植株生长。

3. 田间试验

在田间试验中，未接种对照组的草莓根腐病发病率为41.67%，病情指数为31.67。施用DH18后，发病率显著降至10.00%（P < 0.001），病情指数降至3.33（P < 0.001），防效达89.49%。同时，DH18施用显著提高了多项农艺性状，其中茎粗增幅最大（43.75%，P < 0.001），冠径增加31.91%（P < 0.01），叶柄长度增加10.84%（P < 0.01），叶宽增加9.33%和匍匐茎数增加21.26%（P < 0.05）。此外，DH18接种显著提高了土壤养分有效性，铵态氮含量增加42.19%（P < 0.01），速效磷含量增加49.17%（P < 0.01），速效钾含量增加38.96%（P < 0.05）。叶片中磷含量增加27.0%（P < 0.05），钾含量增加21.08%（P < 0.01）。

4. 基因组分析与功能表征

DH18基因组由单一环状染色体组成，全长3,929,791 bp，GC含量为46.50%，包含3,757个蛋白编码基因、27个rRNA基因、86个tRNA基因、13个CRISPR-Cas系统、8个基因组岛和4个前噬菌体区域。基于平均核苷酸同一性和数字DNA-DNA杂交值的系统发育分析证实DH18属于贝莱斯芽孢杆菌物种。eggNOG功能注释将基因分为22个功能组，其中氨基酸转运与代谢（280个基因）和碳水化合物转运与代谢（224个基因）最为突出。CAZy数据库分析鉴定出143个碳水化合物活性酶（CAZymes），包括46个糖苷水解酶（GHs），其中包含能够降解真菌细胞壁的几丁质酶（GH18和GH23）和其他水解酶（GH1、GH3、GH5、GH13和GH32）。antiSMASH分析预测了12个次级代谢产物生物合成基因簇，其中6个簇与已知抗菌代谢物（丰原素fengycin、芽孢菌素bacillaene、大环内酯素H macrolactin H、芽孢杆菌素bacilysin、芽孢杆菌素bacillibactin和地非西丁difficidin）的生物合成基因簇具有100%相似性，簇8与表面活性素生物合成基因簇有82%相似性。此外，DH18基因组还携带参与磷溶解、钾溶解、IAA生物合成和铁载体产生的植物促生相关基因。

5. DH18代谢产物的鉴定

DH18的蛋白提取物和挥发性代谢物对尖孢镰刀菌FO-1均表现出显著抑制效果，抑制率分别为24.04%和34.10%。LC-MS分析鉴定出2,592种非挥发性代谢物，其中6种主要抗菌成分包括芥酸酰胺、苯丙氨酸、对羟基苯甲酸乙酯、柠檬酸、表面活性素和水杨酸；3种促生代谢物包括柠檬酸（与溶磷相关）、邻苯二酚酸（与铁载体产生相关）和5-羟基吲哚-3-乙酸（与IAA产生相关）。GC-MS分析鉴定出90种挥发性有机化合物（VOCs），其中3种抗真菌成分包括5-甲基-2-庚酮、3-甲基-1-丁醇和2-壬醇。进一步的平板试验证实，DH18产生的全部9种抗菌代谢物均能有效抑制FO-1生长。

6. DH18诱导的草莓根际微生物群落变化

高通量扩增子测序共获得567,383条细菌和608,738条真菌原始序列，聚类为2,604个细菌和579个真菌OTUs。DH18接种显著提高了细菌和真菌群落的α多样性（Shannon指数，P < 0.001）。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，DH18接种显著改变了根际微生物结构，细菌群落（Adonis2，R2 = 0.804，P = 0.007）和真菌群落（Adonis2，R2 = 0.874，P = 0.008）均与对照组显著分离。在门水平上，DH18接种使厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度分别显著增加165.70%（P < 0.01）和67.54%（P < 0.001），子囊菌门（Ascomycota）相对丰度显著降低7.20%（P < 0.001）。在属水平上，芽孢杆菌属、假单胞菌属和Chryseolinea的相对丰度分别显著增加231.24%（P < 0.001）、98.57%（P < 0.001）和78.64%（P < 0.001）；被孢霉属丰度增加3345.68%（P < 0.001），而镰刀菌属下降33.76%（P < 0.001）。LEfSe分析（LDA评分> 4.0，P < 0.05）鉴定出58个细菌判别性生物标志物和25个真菌判别性分类群，假单胞菌属和芽孢杆菌属是DH18组的优势标志物，被孢霉属在DH18组占主导，而镰刀菌属是对照组的主要生物标志物。

四、讨论与结论

讨论部分指出，贝莱斯芽孢杆菌DH18通过多重机制实现病害抑制和生长促进。全基因组分析揭示了DH18的"酶学武器库"和"化学防御系统"，包括能够降解真菌细胞壁多糖结构的CAZymes，以及编码表面活性素和丰原素等脂肽类抗生素、芽孢菌素和地非西丁等广谱抗菌物质的生物合成基因簇。代谢组学分析证实DH18通过合成非挥发性功能溶质和挥发性气体信号分子，建立了"接触作用"和"空间生物熏蒸"相结合的多层防御和促进机制。微生物群落分析表明，DH18的引入可能促进更有利于某些有益细菌类群的根际微环境，真菌群落经历了明显的"去病原化"演替，特定病原菌库的耗竭和有益真菌的富集与田间根腐病发病率降低高度一致，为"微生物组介导"的病害抑制机制提供了支持证据。然而，当前实验设计无法完全区分群落变化是DH18活动的直接结果还是植物健康改善和病原菌压力降低的间接后果，未来需要结合DH18单独处理、未处理空白对照和时间序列采样来阐明因果关系。此外，盆栽系统与开放农业生态系统之间存在"生态尺度差距"，未来研究需要从"机制阐明"转向"田间验证"，进行跨区域、多生长周期的田间微生物组监测。

研究结论指出，本研究分离获得一株兼具抑制草莓镰刀菌根腐病和促进植物生长的双功能PGPR菌株贝莱斯芽孢杆菌DH18。DH18基因组携带多个与病原菌抑制和生长增强相关的功能基因，同时合成多种非挥发性和挥发性抗菌及促生功能物质，并有效重塑土著根际微生物组，为宿主植物建立更有利和稳定的微生物环境。综上所述，菌株DH18通过涉及基因组潜力、代谢物多样性和根际微生物群落有益调控的整合机制，抑制草莓镰刀菌根腐病并促进植物生长。