非芳香族噁唑[5,4-d]嘧啶衍生物的π-堆叠相互作用的结构机制及其在果蝇（Galleria mellonella）模型中的神经活性研究

《Bioorganic Chemistry》：Structural insight into π-stacking interactions of non-aromatic oxazolo[5,4- d]pyrimidine derivatives and their neuroactivity in a Galleria mellonella model

　　• 通过密度泛函理论（DFT）、差示扫描量热法（DSC）、热重分析（TG）和X射线衍射（XRD）确定了氧杂唑[5,4-d]嘧啶的性质。• 在非芳香杂环骨架中识别出了π堆叠相互作用。• 电子结构分析（EDA）和非共价相互作用（NCI）方法为晶体中相互作用的本质提供了见解。• 使用Galleria mellonella模型评估了神经生物学活性。• 发现化合物5和6会影响幼虫的神经系统。

引言
杂环化合物是一种具有环状结构的有机分子，其中至少包含一个杂原子，在材料科学和药物化学中具有重要意义[1] [2]。据统计，超过85%的生物活性成分含有杂环结构[3]。有趣的是，在EMA批准的药物中，吡咯啶和吡啶是最常见的杂环结构[4]，并且在寻找新药物的过程中被广泛研究[5] [6] [7] [8]。另一方面，氧杂唑[5,4-d]嘧啶在其芳香融合骨架的第1、4、6位含有氮原子，在第3位含有氧原子，这类杂环化合物具有广泛的生物活性，这激发了本研究。其电子性质和平面结构通常有助于与分子靶点进行特异性相互作用。据报道，氧杂唑[5,4-d]嘧啶具有抗癌、抗血管生成、抗病毒或免疫抑制等活性[9]。氧杂唑[5,4-d]嘧啶的作用机制与抑制VEGFR2、EGFR、FGFR1和CB2等受体或JAKs和AURKA等非受体蛋白激酶有关。此外，氧杂唑[5,4-d]嘧啶衍生物还被发现可以诱导细胞凋亡，涉及抗凋亡蛋白抑制剂和caspase级联激活剂[10]。值得注意的是，即使是部分芳香性的氧杂唑[5,4-d]嘧啶骨架衍生物也表现出强大的生物活性。一些早期的研究表明，氧杂唑[5,4-d]嘧啶-7-酮类化合物作为嘧啶拮抗剂或HGPRT抑制剂具有抗癌活性[11] [12]。最近的研究发现，氧杂唑[5,4-d]嘧啶-7(6H)-亚胺衍生物对MCF7乳腺癌细胞具有细胞毒性，并且其活性可与FDA批准的药物tivozanib相当[13]。

π堆叠是一种典型的非共价分子间相互作用，通常发生在芳香环之间。Hunter和Sanders在1990年首次全面描述了这些相互作用的本质，并提出了一个电静力模型来解释其起源和优选几何构型[14]。自那时以来，π堆叠在现代化学和分子生物学中得到了广泛的应用。作为一种可逆相互作用，π堆叠在超分子化学、晶体工程和材料科学中具有巨大潜力。它可以用于合成新型复合材料，如基于碳的材料、石墨烯基纳米材料、胶束和水凝胶[15] [16]。此外，π堆叠的非破坏性特性对于核碱基堆叠、蛋白质折叠和生物传感等过程非常重要[17]。它可能有助于与各种受体或酶相互作用，特别是在中枢神经系统（CNS）中，其中在分子识别中起关键作用[18] [19] [20]。最后，π型相互作用可用于控制释放不同类型的药物，例如抗癌剂、肽和核酸[21]。

除了芳香或杂芳香系统中观察到的四种经典π堆叠类型外，最近的研究还表明非芳香骨架也可以发生π堆叠。含有局部π键的化合物，如醌类、金属螯合环或平面有机自由基（例如四氰乙烯），表现出类似π堆叠的相互作用。这些相互作用通常比分散的π体系之间的相互作用较弱且方向性较低。与芳香环的π堆叠不同，后者主要依赖于色散和电四极矩，而醌类和其他非芳香多烯体系主要通过电静力相互作用[16]。值得注意的是，羰基的孤对电子与π体系之间的堆叠相互作用对蛋白质构象的稳定起着重要作用。π堆叠的一个有趣特性是其对环境条件（如pH值和氧化还原电位）的敏感性[22] [23]。这些发现扩展了π-π堆叠的经典定义，表明即使在缺乏芳香稳定性的情况下，具有可访问π电子密度的系统在适当的几何和电子条件下也可能表现出类似堆叠的相互作用。理解这些分子间相互作用的本质对于材料结构、热学和电子性质的工程设计至关重要。

我们之前报道的6-N-苯基氧杂唑[5,4-d]嘧啶-7(6H)-亚胺衍生物（图1）所展示的有希望的结构特征促使我们进一步研究它们的固态性质、电子结构和体内生物效应。这些化合物的合成、光谱表征和结构分析已在之前的研究中详细描述[24]。（见图2。）（见表1。）

在这项工作中，对氧杂唑[5,4-d]嘧啶衍生物进行了全面的物理化学研究。目的是应用密度泛函理论（DFT）计算、差示扫描量热法结合热重分析（DSC–TG）和单晶X射线衍射（XRD）来分析分子间相互作用的本质和测试化合物的热稳定性。X射线衍射分析有助于识别晶体结构中存在的π型分子间相互作用。此外，还应用了能量分解分析（EDA）和非共价相互作用（NCI）方法对这些相互作用进行了详细表征。计算研究还可以评估孤立分子的电子性质和反应性参数。理论评估的参数包括最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO），这些都是分子轨道理论的基本概念。HOMO–LUMO能级有助于理解测试化合物的电子性质和反应性。DSC-TG方法使我们能够将结构特征与热稳定性和电子稳定性参数联系起来。总体而言，这项研究提供了对非完全芳香环之间非共价相互作用方面的更深入了解，可能有助于设计更稳定的有机材料。

特别是，使用Galleria mellonella（大蜡蛾）评估了一系列氧杂唑[5,4-d]嘧啶-7(6H)-亚胺1–9的物理化学性质的生物学相关性。G. mellonella是一种生长迅速、繁殖能力强、体型小、生命周期短的模式生物[25]。目前，G. mellonella幼虫被广泛用作抗菌剂毒性和有效性研究[26] [27] [28] [29] [30] [31]、微生物毒力和致病性[32] [33] [34] [35] [36] [37]以及抗生素敏感性[38] [39]的体内模型。从行为角度来看，G. mellonella幼虫是神经科学和临床前医学中的有希望的模型，可以评估药物的药理效应[40]。毛虫的神经系统在功能和解剖学上相对简单[41]。它与肌肉系统和内分泌系统的相互作用是行为分析的基础，可以揭示功能调节，作为不良或治疗效果的早期指标[42]。通过强制喂食或腹腔注射给予测试化合物后，监测了幼虫的反应和状态。评估了行为参数的变化，如姿势、运动和逃避反应[40] [43]。在这项研究中，功能指标由移动的总距离和平均速度定义。

### 数据片段
#### X射线晶体结构确定
在XtaLAB Synergy R（DW系统）上收集了单晶X射线衍射数据，该系统使用Cu Kα辐射和Hybrid Pixel Array探测器，在100(2) K下进行测量。用于数据收集和数据处理的程序为CrysAlisPro 1.171.42.50a（Rigaku OD，2022年）[44]。结构通过直接方法确定，然后使用SHELXL-2019/2程序和各向异性热参数进行全矩阵最小二乘法精修[45]。XP [46]程序也被用于处理数据。

#### π相互作用
通过X射线单晶衍射实验确认了一系列非完全芳香的6-N-苯基氧杂唑[5,4-d]嘧啶-7(6H)-亚胺衍生物1–9的分子结构（图6）。化合物1的晶体特征已在之前的研究中描述[24]。在本研究中，其他化合物的适宜晶体是通过缓慢蒸发溶剂（DMSO：化合物3、5、6、8、9）或丙酮（化合物2、4、7）获得的。

#### 结论
在本研究中，报道了6-N-苯基氧杂唑[5,4-d]嘧啶-7(6H)-亚胺衍生物1–9的物理化学表征、量子化学计算和神经生物学活性。有趣的是，晶体学结果结合计算分析表明，尽管氧杂唑[5,4-d]嘧啶骨架在形式上不是完全芳香的，但它能够在晶体结构中形成π型分子间相互作用。特别是，XRD研究证实了...

#### 作者贡献声明
Aleksandra Sochacka-?wik?a：撰写 - 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、监督、项目管理、方法论、研究、数据管理、概念化。
Andrzej Regiec：撰写 - 审稿与编辑、方法论。
?aneta Czy?nikowska：撰写 - 初稿撰写、可视化、研究。
Anna Kwiecień：撰写 - 初稿撰写、可视化、研究。
Igor Mucha：撰写 - 初稿撰写、可视化、研究。
Adam Junka：...

#### 资金来源
本研究由弗罗茨瓦夫医科大学资助，资助编号为SUBZ.D090.26.009、SUBZ.D290.26.010和SUBZ.D300.26.018。

#### 利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

#### 致谢
计算工作使用了弗罗茨瓦夫网络与超级计算中心（https://wcss.pl）提供的资源，资助编号为305。作者感谢弗罗茨瓦夫网络与超级计算中心（WCSS）分配的CPU时间。

### 作者列表
Aleksandra Sochacka-?wik?a | Andrzej Regiec | ?aneta Czy?nikowska | Anna Kwiecień | Igor Mucha | Adam Junka | Bart?omiej Dudek | Zuzanna St?pnicka | Aleksandra Woytoń | Adrianna Pyra | Anna Pyra | Marcin M?czyński