泰国首五例猴痘病毒分支Ib病例的基因组特征分析（2024年8月–2025年3月）

《Microbiology Spectrum》：Genomic characteristics of the first five monkeypox virus clade Ib cases in Thailand: August 2024–March 2025

　　

摘要

继2024年8月刚果民主共和国出现猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）分支Ib（clade Ib）之后，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）因持续传播和国际扩散宣布其为国际关注的突发公共卫生事件。研究人员对2024年8月至2025年3月期间在泰国检测到的首批分支Ib病例进行了特征分析，并评估了其系统发育关系。研究人员对疑似病例的皮损拭子进行了全基因组测序（whole-genome sequencing）。系统发育分析纳入了分支Ia（DQ011155.1）以及来自GISAID的全球分支Ib序列，确认所有泰国分离株均为分支Ib。基因组显示与国际上报告的分支Ib病毒具有密切相关性，这与患者的旅行史一致。与分支Ia参考基因组相比，所有分离株均存在C3L基因区域1140 bp的缺失，以及52至61个氨基酸替换。基因组序列已提交至GISAID和NCBI，以支持疫情应对并增进对流行病学模式的理解，从而推动更有效的公共卫生干预措施。

论文解读：泰国首五例猴痘病毒分支Ib病例的基因组特征与溯源分析

一、研究背景与问题

猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）属于正痘病毒属（Orthopoxvirus genus），基因组为约197 kbp的双链DNA，编码约200个推定基因，两端各含7 kb反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。MPXV传统上分为两个分支：中非或刚果盆地分支（clade I）与西非分支（clade II），其中clade I致病性更强、病死率更高。2022年7月，世界卫生组织（WHO）因全球多国暴发猴痘疫情宣布国际关注的突发公共卫生事件（public health emergency of international concern, PHEIC），该次疫情主要由clade IIb亚分支驱动。2024年8月，WHO因clade Ib在刚果民主共和国出现并呈现持续人际传播和国际扩散而再次宣布PHEIC。此前clade I尚未在非洲以外地区被观察到，其潜在的国际传播风险引发全球关注。

2024年8月起，瑞典、泰国、英国、美国加利福尼亚州、德国、印度、中国等国相继报告与旅行相关的MPXV clade Ib病例。泰国于2024年8月确认亚洲首例clade Ib病例。然而，clade Ib病毒的基因组特征、系统发育关系及其对现有检测方法的影响尚不明确，亟需开展系统的基因组学研究以阐明其流行病学模式并指导公共卫生应对。

二、研究内容与结论概述

研究人员对2024年8月至2025年3月间泰国检测到的5例MPXV clade Ib病例进行了全基因组测序和系统发育分析，阐明了这些输入病例的基因组特征和进化关系。研究发现，泰国5例clade Ib病例的基因组与国际上报告的clade Ib病毒高度相关，符合患者的旅行史。所有分离株均存在C3L基因区域1140 bp的特征性缺失，以及52至61个氨基酸替换。系统发育分析揭示了至少3次独立的输入事件：病例1来自刚果民主共和国（2024年8月），病例2–4来自阿拉伯联合酋长国（2024年12月底–2025年1月，同源输入），病例5亦来自阿联酋但为第二次独立输入（2025年3月），而非持续的本土传播。该C3L基因区域的缺失直接影响依赖该区域扩增的商业化实时荧光PCR检测试剂盒的性能，可能导致检测灵敏度降低或结果误判。研究结果强调了基因组监测在准确诊断、病毒进化和疫情应对中的关键作用。基因组序列已提交至GISAID和NCBI数据库，以支持全球疫情应对。

三、关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：（1）实时荧光PCR检测：使用两种商业化试剂盒（Uni-Medica猴痘病毒及中/西非分支分型多重PCR试剂盒和QIAstat-Dx病毒性水疱panel检测试剂盒）进行MPXV筛查和分支初步鉴定；并采用实验室自建的clade Ib特异性实时荧光PCR（靶向dD14–16区域）进行确证。（2）全基因组测序：采用Illumina平台（Viral Surveillance Panel V1富集后于MiniSeq测序）和Oxford Nanopore Technologies平台（连接测序试剂盒V14，R10.4.1流动池，MinION Mk1B设备）对皮损拭子样本进行测序。病例1仅获得Illumina短读长数据（通过DRAGEN Microbial Enrichment Plus分析）；病例2–5为Illumina与ONT混合组装（minimap2比对、samtools合并、bcftools变异 calling，参考基因组DQ011155.1），基因组覆盖度为99.1%–100%，平均测序深度966–3640×。（3）系统发育分析：使用Nextstrain v10.3.0流程，MAFFT进行序列比对，IQ-TREE进行最大似然推断，TreeTime进行时间校准，构建时间分辨的最大似然系统发育树；另用ModelFinder选择最佳替代模型（HKY+F+R3），以1000次超快自举（UFBoot）和1000次SH-aLRT评估分支支持度。（4）变异分析：使用Nextclade v3.21.2（Mpox virus Clade I数据集）进行核苷酸和氨基酸突变分析。背景序列为2023–2025年间来自NCBI和GISAID的250条clade Ib全球基因组序列。

四、研究结果

人口学与流行病学特征：5例病例年龄37–66岁，均为异性恋者，全部报告有亲密或性接触史。病例1有刚果民主共和国旅行史；病例2–5均在阿联酋迪拜工作后直飞泰国。病例2和3互为朋友。所有患者均有症状性MPX，皮损数量10–80处。

实验室检测结果：所有5例病例的实时荧光PCR均检出MPXV阳性。商业化分型试剂盒可检出MPXV但无法区分clade I和clade II。QIAstat-Dx Viral Vesicular Panel第一版将病例1误判为clade II；第二版仅报告正痘病毒阳性未作分支判定。clade Ib特异性RT-PCR确证病例1、3、4、5为clade Ib，病例2因样本不足未能检测。全基因组测序确认全部5例为clade Ib。

时间分辨系统发育树：病例2–4形成紧密的单系群，采样时间接近（2024年12月底–2025年1月），提示共同来源输入；病例5与病例2–4共享近期共同祖先但存在时间和遗传距离上的分离，支持为来自阿联酋的第二次独立输入；病例1与刚果民主共和国相关多样性序列聚为一支，提示第三次独立输入。系统发育分析表明泰国至少经历了3次clade Ib独立输入，而非2024年12月以来的持续本土传播。

基因组分析：与clade Ia参考基因组（DQ011155.1，Zaire_1979-005）相比，所有clade Ib基因组均存在C3L基因区域1140 bp缺失，这一缺失在Illumina和ONT两种测序平台的数据中均得到验证。该缺失直接影响了依赖C3L基因扩增的clade Ia商业化实时荧光PCR检测试剂盒的性能。氨基酸替换分析显示，5例基因组的氨基酸替换数为53至61个，与我国报告的clade Ib病毒（57个氨基酸突变）相当。病例1的核苷酸和氨基酸变异数最多，在OPG164基因中检测到独特的氨基酸替换（R134T、Q137D、T138S、I139V、Y140A、Q141G、N142S、T144L、V145L、V146I）；病例5在此前病例中未见的OPG003（R317C）、OPG003_dup（R317C）和OPG030（D43N）中检测到4个独特氨基酸替换。病例2–5的突变谱高度相似，与其流行病学背景一致。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，泰国首例clade Ib病例是非洲以外报告的第二例，仅次于瑞典。研究发现商业化clade I实时荧光PCR试剂盒因C3L基因缺失而无法可靠检出clade Ib，这暴露了现有诊断方法的局限性。研究人员将QIAstat-Dx第一版无法区分clade II与正痘病毒的问题反馈给Qiagen公司，促使该公司修订了第二版试剂。研究期间所有5例病例均与泰国以外的旅行或暴露相关，未发现持续本土传播的证据。C3L基因编码补体控制蛋白（complement control protein, VCP），可抑制补体系统激活从而帮助病毒逃逸先天免疫。该蛋白存在于clade I MPXV和天花病毒中，但在clade II MPXV中缺失。这一缺失的生物学意义尚不明确，其与疾病严重程度的关系有待进一步研究。orthologous区域基因组变异的累积提示多重突变与病毒人际传播能力增强之间可能存在关联。研究的主要局限性为样本量较小。

研究结论：本研究确定了泰国首批5例MPXV clade Ib病例，关键发现包括C3L基因缺失这一特异性基因组标记的鉴定，以及跨区域的系统发育聚类。C3L缺失的发现揭示了现有clade I实时荧光PCR检测试剂盒的局限性，表明有必要开发分支特异性实时荧光PCR检测方法以准确检测MPXV变异株。未来持续开展病例识别和基因组监测将有助于开发更灵敏特异的检测方法，并加深对病毒适应与进化的理解，为公共卫生策略的制定提供依据。