《Microbiology Spectrum》：Optimization of fermentation conditions for Metarhizium robertsii and its effect on rice growth
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罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）ARSEF 23是一种重要的昆虫病原真菌和植物内生真菌，兼具昆虫防治和促进植物生长的双重作用，这使其在农业生产中得到广泛应用。然而，M. robertsii（简称MAA）对水稻的促生长效应及其潜在机制尚
罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）ARSEF 23是一种重要的昆虫病原真菌和植物内生真菌，兼具昆虫防治和促进植物生长的双重作用，这使其在农业生产中得到广泛应用。然而，M. robertsii（简称MAA）对水稻的促生长效应及其潜在机制尚未完全阐明。本研究验证了MAA菌株本身及其发酵上清液对水稻的促生长效应。通过单因素试验和响应面法（response surface methodology, RSM），以水稻根长为主要指标对MAA的发酵条件进行优化，并初步探讨了促进植物生长的潜在机制。结果表明，MAA及其发酵上清液对水稻均表现出显著的促生长效应。蔗糖和蛋白胨分别为最佳碳源和氮源。当发酵上清液在pH 6.0、0.2% β-丙氨酸（β-Ala）和100 μmol/L硫酸铝条件下获得时，观察到最显著的促生长效果，水稻根长较对照组提高21.7%，并进一步影响MAA的代谢产物。此外，MAA在水稻根部的相对丰度增加了400倍，强烈表明其与根系存在关联，并且通过抑制病原菌属（如镰刀菌属Fusarium sp.）和富集促进植物生长的有益菌属（如木霉菌属Trichoderma sp.）显著重塑了根部内生真菌群落。同时，在施用MAA发酵上清液的水稻中还观察到叶绿素含量显著增加（较对照提高28.17%）和根毛更为丰富。总之，这些基于水培的研究结果为开发和应用环境友好、高效MAA源生物接种剂用于水稻生产提供了理论依据，但仍需田间验证。
罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）ARSEF 23（简称MAA）是一种兼具昆虫病原和植物内生功能的真菌，在农业中已被广泛用作生物防治和促生剂。然而，其促进水稻生长的效果和机制尚不清楚，且缺乏针对水稻的发酵条件优化。为此，研究人员以水稻根长为主要指标，采用单因素试验和响应面法对MAA的发酵条件进行了系统优化，并初步探索了其促生机制。该研究首先通过水培试验验证了MAA及其发酵上清液对水稻的促生作用，随后优化了碳源、氮源、pH、发酵时间、β-丙氨酸（β-Ala）和硫酸铝[Al?(SO?)?]等参数，并通过扩增子测序分析了根内生微生物群落的变化。主要结论包括：蔗糖和蛋白胨为最佳碳、氮源；优化条件下（pH 6.0，0.2% β-Ala，100 μmol/L Al?(SO?)?）发酵上清液使水稻根长增加21.7%，叶绿素含量提高28.17%，根毛增多；MAA根部相对丰度增加400倍，并显著重塑根内生真菌群落，抑制镰刀菌属等病原菌、富集木霉属等有益菌。这些发现为开发绿色、高效的MAA源生物接种剂提供了理论依据，但需田间验证。
关键技术方法概述：菌株MAA由徐玉泉教授提供（中国农业科学院生物技术研究所），水稻材料为蜀恢527（SH527）。促生试验采用水培系统（Hoagland营养液）。发酵优化采用单因素试验结合响应面法（RSM），以7天水稻根长为响应值。根内生微生物群落通过ITS和16S rRNA基因扩增子测序（Illumina MiSeq平台）分析，数据经QIIME2流程处理，分别以UNITE和SILVA数据库进行物种注释。叶绿素含量用SPAD-502 Plus叶绿素计测定，根毛形态用共聚焦显微镜观察。统计采用单因素方差分析和Fisher最小显著差数检验（P<0.05）。
研究结果：
1. MAA发酵上清液对水稻的促生效应：水培试验表明，与对照相比，施用MAA发酵上清液的水稻苗高增加13.55%，根长增至对照的1.164倍，不定根数增加12.5%，差异均显著（P<0.05）。
2. MAA对根内生真菌群落的影响：ITS扩增子测序显示，MAA处理组（M+）中Metarhizium相对丰度从0.00045%升至0.18%，增加了400倍（P<0.01）。病原菌Fusarium sp.相对丰度降低76.15%，Dictyostelium sp.、Pezizaceae sp.分别下降47.81%和89.67%，Gibberella sp.亦受抑制。有益菌Trichoderma sp.和Byssochlamys sp.分别富集79.71%和0.0032%（P<0.01）。
3. MAA对根内生细菌群落的影响：16S rRNA基因测序表明，M+组未分类肠杆菌科丰度下降，而植物促生菌Herbaspirillum和Acidovorax显著富集。
4. 不同培养条件对MAA生长和水稻促生的影响：通过单因素试验系统考察六个变量，发现碳源为蔗糖、氮源为蛋白胨时促生效果最佳，植物株高和根长分别较对照提高24.59%和77.17%（株高）及22.55%和72.73%（根长）。pH 6.0、发酵7天、添加0.2%β-Ala和50 μmol/L Al?(SO?)?均显著增强促生活性。固体培养基上菌落形态和直径随培养基成分显著变化，且与促生效果呈正相关。
5. 单因素试验：发酵时间与促生效果呈负相关，7天最优（株高15.46 cm）。β-Ala在0.2%时效果最佳（7天株高15.66 cm）。Al?(SO?)?在100 μmol/L时株高最大（15.69 cm），20 μmol/L时根长最优（11.9 cm）。蔗糖和蛋白胨分别使15天根长达14.98 cm和12.54 cm。pH 6时根长最大（23.79 cm）。
6. 响应面试验优化结果：建立的回归模型显著（F=16.11，P<0.0001），交互项a×c（蔗糖×β-Ala）和b×c（pH×β-Ala）显著。最优条件为蔗糖浓度26 g/L，pH 6.03，β-Ala浓度0.20%，Al?(SO?)?补加量96.07 μmol/L，预测根长12.23 cm。
7. 最佳培养条件的建立与验证：采用优化条件（蔗糖26 g/L，pH 6.0，0.2% β-Ala，100 μmol/L Al?(SO?)?）重复验证，平均根长为11.95 cm，与预测值12.23 cm吻合。
8. 不同培养对水稻根毛和SPAD的影响：共聚焦显微镜观察显示，最优处理组根毛较对照显著更密、更长。SPAD值在发酵7天（29.723）、β-Ala 0.2%（30.513）、Al?(SO?)? 10 μmol/L（30.94）、碳源为玉米粉/蔗糖（约28.29/28.54）、氮源为(NH?)?SO?（31.41）、pH 7（33.33）时达到较高水平。
9. 基于表型和微生物数据的促生机制初步探索：综合表型、生理和微生物数据，研究人员提出双重途径模型。直接途径包括类生长素刺激和光合能力增强（如根毛增多、根长增加21.7%、SPAD提高28.17%）；间接途径为根际真菌群落重塑，即抑制病原菌（Fusarium降低76.15%）并富集有益菌（Trichoderma增加79.71%）。优化添加物β-Ala和Al?(SO?)?可能促进MAA分泌生物活性代谢产物，但缺乏直接分子证据。
讨论总结：该研究首次确认MAA及其发酵上清液对水稻的促生作用，并通过响应面法优化了发酵工艺。研究发现MAA能与水稻根部形成强关联，通过重塑根部微生物群落、抑制病原菌和富集有益菌间接促进生长，同时可能通过分泌类生长素物质和增强光合作用直接刺激生长。然而，研究存在水培系统不能完全模拟土壤复杂性、缺乏直接分子证据、ITS测序无法区分接种菌株与天然菌株、摇瓶与发酵罐差异等局限性。未来需进行田间试验和代谢组学分析加以验证。研究结论的翻译如下：本研究成功将罗伯茨绿僵菌（M. robertsii）确认为一种可用于水稻的植物促生剂。通过响应面法优化关键发酵条件（碳/氮源、pH、β-Ala和Al?(SO?)?），研究团队制备出一种发酵上清液，可显著增加水稻根长（21.7%）、提高叶绿素水平并促进根系生长。此外，基于表型和群落水平的证据，研究人员提出其促生效应可能涉及直接生理刺激和间接调节根际真菌群落双重机制，特别是抑制病原微生物并促进有益真菌类群。该结果提供了优化的发酵方案和机制理解，凸显了M. robertsii作为可持续水稻生产中开发新型微生物接种剂的可行候选。
