PACS1综合征变异改变了发育中皮层类器官的蛋白质组学格局

《iScience》：PACS1 syndrome variant alters the proteomic landscape of developing cortical organoids

　　

摘要

来自患者的脑类器官已被用于模拟神经发育障碍（NDDs）并确定致病机制。尽管大多数研究评估的是NDDs变异体如何影响转录组，但涉及蛋白质组的研究仍然有限。在此，我们考察了PACS1 p.R203W变异体（导致PACS1综合征）对脑类器官蛋白质组景观的影响，并将结果与转录组数据集进行了比较。尽管我们观察到转录本和蛋白质之间存在有限的重叠，但大多数失调过程趋于一致。蛋白质组数据不仅加强了这些发育过程在p.R203W发病机制中的重要性，还揭示了转录组分析未能发现的失调通路。PACS1(+/R203W)类器官中关键的失调转录本和蛋白质被归类为NDDs致病基因和自闭症谱系障碍（ASD）风险基因。我们的结果凸显了蛋白质组学在补充转录组学研究方面的潜力，通过提供更深入的NDDs机制洞察，同时揭示仅通过转录组学可能无法识别的额外治疗靶点。

## 引言

神经发育障碍（NDDs）具有异质性，通常表现为复杂的病因。多项大规模遗传学研究调查了NDDs（如自闭症谱系障碍（ASD）、智力障碍（ID）和癫痫）的病因，并鉴定出数百个风险基因。然而，我们对所观察到的遗传变异体作用机制的理解仍然滞后，从而限制了遗传发现向临床治疗的转化。

近年来，来自患者的脑类器官越来越多地被用于鉴定致病机制和潜在治疗靶点。虽然大多数此类研究调查风险基因和致病变异体如何影响转录组，但考虑蛋白质组的研究仍然有限。然而，mRNA水平并不总是能预测蛋白质水平，因为蛋白质的表达和降解受到转录之外的机制调控。在此，我们发现研究脑类器官在成熟过程中的蛋白质组景观可以进一步提高NDDs发病机制的解析度，补充转录组分析所观察到的机制。为此，我们利用串联质谱标记（TMT）质谱法考察了致病变异体PACS1 p.R203W对脑类器官蛋白质组景观的影响，该变异体是PACS1综合征的致病变异。

PACS1综合征（MIM615009）的特征包括ASD、智力障碍、颅面异常和癫痫，其由磷酸呋环酸簇分选蛋白1（PACS1）基因中的反复新发c.607C>T变异导致，该变异引起精氨酸到色氨酸（p.R203W）的替换。该错义变异存在于所有已报告的患者中，除了一例已知的精氨酸到谷氨酰胺p.R203Q替换外。PACS1编码一种多功能分选蛋白，是呋环蛋白定位到反高尔基网络（tGN）所必需的。除了tGN回收外，PACS1还介导内化的呋环蛋白从早期内体到细胞表面的回收，以及蛋白质向初级纤毛的递送。PACS1已被证明与50多种其他蛋白相互作用，通过酸性簇分选基序进行。PACS1也存在于细胞核中，在那里它介导DNA复制修复，参与病毒转录本的核输出。

近期报道探讨了PACS1 p.R203W变异体的发病机制。仅在皮层神经元中过表达PACS1 p.R203W的小鼠表现出树突分支增多和突触后电流减少，这可能是由于PACS1 p.R203W与HDAC6之间的致病性相互作用。针对PACS1和HDAC6的反义寡核苷酸（ASOs）可改善这些缺陷。患者来源的脑类器官转录组分析揭示，在幼嫩神经元中存在PACS1 p.R203W依赖的细胞突起组织失调，而成熟神经元表现出突触信号过程的调节异常。对自发电活动的后续表征显示，携带p.R203W变异体的诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元表现出不同步性增加和网络爆发持续时间延长。最后，PACS1综合征相关变异体改变了PACS1的定位，但对秀丽隐杆线虫的神经元形态和突触模式没有影响。尽管这些研究已开始调查PACS1 p.R203W变异体的影响，但该变异体如何影响神经发育的机制仍然知之甚少。这反过来又导致患者的治疗选择有限，目前仅包括非侵入性行为方法以及感觉统合疗法来管理症状。在此，我们评估PACS1(+/R203W)类器官中的发育蛋白质组景观，以进一步了解PACS1综合征的发病机制。然后，我们比较了蛋白质组和转录组方法所发现的失调过程。我们的发现强调了整合多层次监管数据对于捕获NDDs复杂致病机制的重要性。

## 结果

### 脑类器官捕获胎儿脑中观察到的蛋白质组发育轨迹和过程

蛋白质是细胞过程的最终效应因子。因此，在此我们表征了iPSC来源的脑类器官的蛋白质组，以更好地了解p.R203W PACS1如何影响神经发育。类器官在不同分化时间点收集：第21天，此时增殖的神经前体占主导；第40天，此时部分前体细胞已过渡为中间前体细胞和新生的神经元；第90天，此时有丝分裂后神经元是最丰富的群体（图1A）。

**图1 皮层类器官再现脑发育期间的蛋白质组动态**

完整图注

(A) 第21、40和90天来自对照组（上）和PACS1 p.R203W类器官（下）的神经前体蛋白SOX2（红色）和投射神经元标记物CTIP2（洋红色）的表达。比例尺，200 μm。DAPI（蓝色）。

(B) 类器官中检测到的总蛋白质按随成熟时间变化的丰度变化聚类为三大趋势：上调（红色）、下调（蓝色）或稳定（灰色）（左图）。进一步分类检测出四种主要丰度趋势，基于变化的时间点：随时间稳定（聚类stable-up和stable-down）或延迟到第40天（聚类delayed-up和delayed-down）（右图）。每个图中分配到聚类的蛋白质总数在图中有所标示；所有图中的黑线代表每个聚类中所有蛋白质的平均趋势。

(C和D) 随成熟时间上调（红色）和下调（蓝色）的GO术语。内层饼图代表各图中聚类共有的过程。嵌套饼图显示根和分支显著GO富集，饼的宽度与GO术语的–log(p)相关。加粗显示的过程代表文中提及的过程。

(E) 类器官（紫色）和胎儿脑（绿色）随时间共享的上调（红色）和下调（蓝色）GO术语。突触和神经发育相关过程（方框）。类器官对应聚类1至4，而胎儿脑对应聚类A至H。所有富集过程的完整描述包含在表S10中。

使用TMT质谱法，我们在不同发育阶段的类器官中鉴定出3,766个独特蛋白质。约60%的这些蛋白质与在胎儿脑中检测到的蛋白质重叠，而与出生后或成人脑相比，重叠度降低（图S1A和表S1）。蛋白质表达相关性主要观察到类器官内部和早期发育阶段（受孕后第16至26周）的脑样本之间，且蛋白质丰度相关性随类器官成熟度增加（图S1B）。首先，我们旨在了解成熟对照脑类器官的蛋白质组景观。我们通过时间序列和聚类分析鉴定出具有共同时间轨迹的蛋白质组。我们将蛋白质分为三种时间模式：上调、下调和随时间稳定的丰度。上调和下调模式进一步聚类为两种主要轮廓：(1) 连续蛋白质变化，丰度稳定增加/减少（聚类"steady-up"和"steady-down"）；(2) 延迟趋势，蛋白质丰度在早期分化期间（从第21天到第40天）保持稳定，随后在第90天增加/减少（聚类"delayed-up"和"delayed-down"）（图1B和表S2）。

接下来，我们使用基因本体（GO）分析确定这些不同模式涉及的生物过程（表S3）。正如预期的那样，许多发育过程随时间变化，包括神经元分化、轴突延伸、树突形态发生、突触组织/功能的上调（图1C），以及细胞周期和干细胞群体维持的下调（图1D）。这与类器官成熟过程中神经前体细胞分化为神经元的结果一致。在上调聚类中，steady-up主要包含神经发育过程，而delayed-up主要与信号转导相关。同样，steady-down和delayed-down聚类共享细胞周期以及DNA复制或修复的下调（图1D）。稳定蛋白质与初级代谢、基因表达调控以及核糖体/翻译相关过程等基本功能相关（图S1C）。

最后，我们将观察到的类器官过程与从参考数据集获得的发育中胎儿脑动态进行比较（图S1D和表S4）。我们发现类器官和胎儿脑聚类之间存在显著重叠（表S5）。胎儿脑发育期间大多数富集过程都在相应的类器官聚类中被捕获。这些结果证实了我们的脑类器官再现了脑发育的早期阶段，如先前报告，支持了它们用于模拟PACS1综合征中蛋白质失调的使用。

### PACS1 p.R203W致病变异体改变发育轨迹

然后，我们对PACS1综合征患者来源的脑类器官的蛋白质组进行表征，以评估PACS1 p.R203W致病变异体对发育期间蛋白质调控的影响（图1A）。携带p.R203W变异体的类器官在第21天与对照类器官的发育相似，仅有五个蛋白质（HMGB3、HTATSF1、HM13、TCEAL3和TCEAL5）显示出上调（图S2A）。然而，在成熟过程中，与对照组相比，PACS1(+/R203W)类器官中有329个蛋白质表现出失调（表S6）。氧化磷酸化（ATP6V0A1、CYC1、NDUFA7）和细胞内钙离子稳态（ATP1B1、CALB2、LETM1、NPTN）是在携带p.R203W变异体的类器官中由167个上调蛋白质产生的观察到的富集过程之一（图S2B和表S7）。到第40天，大多数失调蛋白质与已建立的PACS1功能相关，涉及内质网（ER）到高尔基体的运输（ARF4、SEC23A、SNAPIN）。第40天上调的蛋白质涉及神经元突起发育，如Eph相关受体酪氨酸激酶的配体EFNB1和转录因子FOXG1。Western blot确认了上调（图S2C）。相比之下，到第90天，神经元突起发育和突触信号相关蛋白质如EFNB3、NF1、VDAC3和SV2A被富集。其他上调过程包括氨基酸代谢（ASS1、GLO1、CTH、HSD17B10、PLOD2、SMS）和甘油脂代谢（PITPNM1、AGPAT4、TMEM68）。有趣的是，PACS1相互作用蛋白PTBP1（参与mRNA加工）和WDR37也被上调（图S2A和S2B）。另一方面，173个下调蛋白质富集于细胞周期分裂、DNA复制和mRNA剪接等过程中。这还包括RNA结合蛋白PCBP4（参与mRNA稳定性）和RNA结合/剪接调节因子PTBP2（也参与脑发育）。中间丝蛋白NES（在增殖和分化中发挥作用）也被发现属于下调蛋白质之一。Western blot确认了NES丰度降低（图S2C）。

在数据归一化和探索阶段（图S3）之后，主成分分析（PCA）表明成熟时间是第21、40和90天比较PACS1(+/+)和PACS1(+/R203W)类器官时变异的最强驱动因素（图S3C–S3E）。因此，我们调查了PACS1变异体的存在是否影响具有共同时间轨迹的蛋白质组。我们使用短时间序列（STEM）Java分析流水线比较了成熟轨迹。PACS1(+/R203W)类器官也表现出在对照中观察到的三种主要模式（上调、下调和稳定）和轮廓（steady vs. delayed）（图2A和表S8）。然而，许多蛋白质切换了丰度模式（图2B）。轮廓重组导致增加四个额外聚类，PACS1(+/R203W)类器官中共发现八个聚类。额外聚类包括与对照中稳定模式相比上调或下调的蛋白质（"stable-up"和"stable-down"聚类），以及在成熟过程中失去对照中观察到的调控并保持稳定的蛋白质（"up-stable"和"down-stable"聚类；表S9）。

**图2 携带PACS1 p.R203W致病变异体的类器官在成熟过程中表现出改变的蛋白质动态**

完整图注

(A) 河图表示PACS1 p.R203W类器官（右）中轮廓聚类的变化与对照组（左）中聚类的对比。y轴上的断点是为了通过移除2,000个随时间保持稳定的蛋白质来改善失调聚类的可视化效果。

(B) 在PACS1 p.R203W类器官中鉴定出四个失调蛋白质聚类；所有图中的黑线代表每个聚类中所有蛋白质的平均趋势。

图表按调控的获得或丧失进行分类：稳定上调群（顶部）和稳定下调群（底部）获得了调控，而上调-稳定群和下调-稳定群则丧失了调控（中间）；(C) 每个失调群的富集生物学功能。稳定上调群（顶部，红色）、下调-稳定群（中间，灰蓝色）和稳定下调群（底部，蓝色）。上调-稳定群由于群大小未显示显著富集。嵌套饼图显示了根和分支级别的显著GO富集，饼图宽度与GO术语的-log(p)值相关。神经发育相关过程以粗体显示。来自PACS1(+/R203W)类器官的稳定上调群在氧化磷酸化（33个蛋白中有23个）、脑发育和神经元分化方面表现出强烈富集。获得上调的蛋白包括葡萄糖转运蛋白GLUT1、转录因子FOXG1以及线粒体基因UQCRQ、VDAC1和ATP5PF（图2C和表S10）。稳定下调群在mRNA加工和翻译的调控方面富集。获得下调的蛋白包括核糖体亚基蛋白RPL38、延伸因子-1复合体α亚基EEF1A1，以及发育蛋白Nestin、BRD2和王氏因子7B家族成员WNT7B。下调-稳定群在核苷酸代谢过程中富集。与代谢相关且丧失下调调控、随时间保持稳定的蛋白也与脑发育和功能相关。这些蛋白包括核糖激酶（RBKS），该酶与葡萄糖代谢障碍相关，最近被发现与精神疾病有关；磷酸核糖焦磷酸合成酶1（PRPS1），该酶与导致听力损失、肌张力低下和共济失调的多种综合征性和非综合征性疾病相关；以及过氧化氢酶（CAT），该酶与氧化应激相关疾病和自闭症谱系障碍（ASD）相关。最后，上调-稳定群由八个蛋白组成，这些蛋白在PACS1(+/R203W)类器官中丧失了时间依赖性上调并随时间保持稳定，且未显示显著富集。然而，在该群中，几种蛋白在脑部具有相关功能，如树突形态发生（SS18L1/CREST）、自噬以及损伤后的神经元突起再生（VIM）和细胞内pH稳态调控（CA2）。这些结果表明，PACS1(+/R203W)类器官的发育轨迹发生了改变，与已知PACS1功能相关的特定神经元/代谢程序和过程（即高尔基体到内质网的囊泡运输）出现了过早或异位上调。尽管观察到的蛋白聚集和神经元及代谢过程的富集可能由细胞类型比例改变所驱动，但单细胞RNA测序和免疫染色证实PACS1 p.R203W变异并未改变类器官的细胞结构组成或组织。为了更好地理解PACS1(+/R203W)类器官中发育轨迹发生改变的可能性，我们利用先前生成的单细胞RNA测序数据进行了伪时间分析。尽管类器官组成相似，但与对照组相比，我们观察到PACS1(+/R203W)类器官的发育轨迹发生了显著变化（KS检验，所有谱系：D = 0.014613，p = 0.01803；图S4）。主要发育轨迹分叉为两个分支，分别代表未成熟神经元和成熟神经元（图S4A和S4B）。伪时间排序显示，PACS1(+/R203W)类器官在较高伪时间值处的细胞密度显著高于对照组，无论是未成熟（图S4C和S4D，中间部分）还是成熟（图S4C和S4D，右侧部分）神经元谱系均如此。单侧Kolmogorov-Smirnov检验证实了在所有测试亚组中PACS1(+/R203W)类器官伪年龄值的累积分布与对照组之间存在差异（图S4）。需要进一步研究以确定这些转录组和蛋白质组变化是否反映了PACS1 p.R203W变异导致的加速成熟。然而，尽管PACS1(+/R203W)类器官表现出早期神经元成熟的特征，但它们也显示了许多mRNA相关过程的失调，包括运输和加工，这些过程可能导致分化缺陷或不完整（表S10）。最后，我们的结果还进一步揭示了PACS1已知互作蛋白在蛋白水平的失调，而这些在转录组水平上未能被解析。与轴突和突触过程相关的时空调节磷酸化蛋白在PACS1(+/R203W)脑类器官中同样受到影响。翻译后磷酸化是蛋白质功能的主要调控机制。因此，我们分析了PACS1(+/R203W)类器官在成熟过程中是否也存在磷酸化改变。类器官中磷酸肽的定量分析共确定了4,238个高置信度磷酸化位点，映射到1,754个独特蛋白（表S6和S11）。在这些映射的磷酸化肽中，1,112个（63.4%）具有对应的蛋白，从而能够根据蛋白丰度校正磷酸化占据率（图S5）。考虑磷酸化丰度的时间序列和聚类分析揭示了与蛋白丰度分析相同的八个簇和稳定模式（图3A和表S12、S13）。然而，在PACS1(+/R203W)类器官中观察到了一个额外的独立簇，由第21至40天之间的磷酸化肽组成（"早期上调"簇）（图3B）。

**图3 PACS1 p.R203W类器官中时间磷酸化动态失调。** 完整图注。图查看器。(A) 瀑布图显示PACS1 p.R203W类器官与对照组相比谱系聚类的变化。Y轴引入了间断以改善失调簇的可视化效果，移除了3,000个随时间保持稳定的修饰。(B) 在PACS1 p.R203W类器官中观察到五个失调磷酸化趋势簇，这些簇要么获得了时间调控，要么丧失了对照组中观察到的原始模式；图中所有黑色线代表每个簇中所有蛋白的平均趋势。图表按调控的获得或丧失进行分类：稳定上调群和稳定下调群与对照组相比获得了时间调控（橙色），而上调-稳定群和下调-稳定群则丧失了时间调控（灰色）。早期上调是一个磷酸化数据集中独有的新簇，同样获得了时间调控（绿色）。(C) 每个失调簇的富集生物学功能。嵌套饼图显示根和分支级别的显著GO富集，饼图宽度与GO术语的-log(p)值相关。神经发育相关过程以粗体显示。在PACS1(+/R203W)类器官中，325个独特蛋白上的共530个磷酸化位点发生失调（表S14）。实例包括两个PACS1已知互作蛋白PACS2（PACS1旁系同源物）和HDAC1，两者在丰度和占据率水平上均显著。PACS1(+/R203W)类器官中PACS2-S437磷酸化增加，这对于PACS2介导的运输和凋亡抑制是必需的。HDAC1在S421和S423残基上的磷酸化降低，这对于其抑制功能至关重要。有趣的是，这两个丝氨酸残基也由CK2磷酸化（CK2被发现丧失了时间调控并在PACS1(+/R203W)类器官中保持稳定）。由于缺乏针对上述磷酸化位点的特异性抗体，未来的验证实验需要确认这些磷酸化事件及其在PACS1综合征发病机制中的潜在作用。鉴于磷酸化可能导致蛋白功能的诱导或抑制，而蛋白本身的激活状态可能对通路活性产生不同影响，我们使用磷酸化位点数据库来了解所观察到的失调磷酸化位点的功能影响。Phosphosite数据库包含51个磷酸化位点的注释，分布在41个独特蛋白中（共530个磷酸化位点），且很少有蛋白具有多个磷酸化位点（图S6和表S15）。为了进行功能富集分析，我们将与对照组相比丰度发生变化的磷酸化蛋白（簇：稳定上调群和稳定下调群）或丧失磷酸化调控的蛋白（簇：上调-稳定群和下调-稳定群）进行分组。尽管早期上调群也获得了上调，但由于其在该数据集中的独特性，我们单独进行了功能富集分析（图3C和表S16）。在PACS1(+/R203W)类器官中随时间获得上调/下调而在对照组中保持稳定的磷酸化蛋白参与轴突发生以及突触功能和组织过程（图3C，橙色饼图）。这些蛋白的实例包括突触素1（SYN1，在丰度和占据率水平上均显著），该蛋白参与突触发生和神经递质释放，其在S568/S570残基上的磷酸化会导致构象变化，阻止其与肌动蛋白或突触囊泡结合；突触囊泡回收蛋白1（SYNJ1，在丰度和占据率水平上均显著），该蛋白在突触囊泡回收中发挥重要作用；AP-3蛋白复合体的β亚基（AP3B2，在丰度水平上显著），这是一个已知的PACS1互作蛋白，有助于形成含网格蛋白的突触囊泡；以及DNM1-S774（在丰度水平上显著），该蛋白通过去磷酸化激活来调节含网格蛋白的胞吞作用。需要进一步的验证实验来确认这些蛋白在PACS1(+/R203W)脑类器官中的磷酸化状态。这些实验将在所需的磷酸化特异性抗体可用后优先进行。同样，与观察到的其他调控获得簇类似，早期上调群在轴突相关功能和组织方面表现出富集，但显示了与Sema3E（SEMA3E）信号传导相关的新术语（图3C，绿色饼图）。这一结果与单细胞RNA测序分析一致，该分析鉴定出SEMA3E在PACS1(+/R203W)脑类器官中上调。我们的蛋白质组数据集显示，虽然SEMA3E本身没有变化，但参与其信号通路的多种蛋白发生磷酸化，包括CRMP1、DPYSL2和DPYSL3（均在丰度水平上显著）。特别地，CDK5对DPYSL2-S522的磷酸化参与轴突导向和棘突发育。未来旨在研究PACS1(+/R203W)模型中SEMA3E信号传导的研究将证实这些观察结果。与此同时，细胞内蛋白运输是丧失调控簇中最富集的过程（图3C，棕色饼图）。在PACS1(+/R203W)类器官中保持稳定的蛋白包括GLI3（在丰度和占据率水平上均显著），该蛋白具有双重功能，作为sonic hedgehog（Shh）通路的转录激活剂和抑制子，其功能取决于磷酸化；以及LIN28A（在丰度水平上显著），这是一种定位在内质网周的RNA结合蛋白，最近被描述为分泌途径基因的全局抑制子。PACS1(+/R203W)类器官中失调的蛋白丰度和磷酸化状态导致收敛过程并与已知神经发育障碍（NDD）相关基因重叠。我们接下来分析了PACS1(+/R203W)类器官中丰度失调和磷酸化状态失调的蛋白身份与先前报道的转录组数据之间的重叠情况。我们使用伪批量方法重新分析了p.R203W类器官的转录组谱以估算基因表达。这在第40天和第90天之间产生了总计454个差异表达基因（图S8和表S17）。令人惊讶的是，我们观察到总蛋白、失调蛋白、磷酸肽和转录组之间重叠率很低，仅有JAM2，这是一种免疫球蛋白亚家族细胞黏附蛋白，也是轴突髓鞘化的关键调节因子（图4A）。然而，多个受影响的进程发生了收敛（图S8）。例如，神经发生、突触组织和轴突相关过程由于RNA表达、蛋白丰度和磷酸化状态随时间在PACS1(+/R203W)类器官中与对照组相比失调而发生富集（图S8）。仅在蛋白和磷酸化水平也观察到收敛过程，包括mRNA运输、肌动蛋白和微管组织以及细胞周期动力学。最后，一些过程是独有的，包括氧化磷酸化和能量产生，这些仅由蛋白丰度失调导致（紫色）；以及RNA剪接，在磷酸化状态上随时间显示上调获得（黄色）（图S7）。这些结果表明PACS1(+/R203W)类器官的发育在不同调控水平上受到干扰。

**图4 PACS1 p.R203W失调的蛋白丰度和磷酸化位点在神经疾病相关基因中富集。** 完整图注。图查看器。(A) 与对照组相比，在PACS1 p.R203W类器官中观察到的所有失调RNA、蛋白和鉴定磷酸化位点之间的重叠身份。(B) 在PACS1 p.R203W失调转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组中富集的基因-疾病关联类型本体论中选择的顶级神经相关类别，校正后p值为0.01。(C) 携带p.R203W致病变异的类器官中失调的神经发育障碍（NDD）和自闭症谱系障碍（ASD）风险基因。基因按RNA、蛋白和磷酸化进行分组。RNA和蛋白丰度组按失调簇着色，而磷酸化簇按主要失调趋势（获得或丧失）着色，如图3所示：调控获得（稳定上调群和稳定下调群）或调控丧失（上调-稳定群和下调-稳定群）。(D) 第40天和第90天时失调RNA（顶部）、蛋白（中间）和磷酸化（底部）的火山图。绿色调的圆圈代表ASD基因，而粉色调的三角形代表NDD基因。接下来，我们调查了与PACS1综合征相比，在其他神经发育障碍（NDD）中是否存在收敛的失调基因。我们使用DISGENET、Simons Foundation ASD（SFARI）和Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）基因数据库对失调蛋白和转录本进行了基因集富集分析。与对照组相比，在PACS1(+/R203W)类器官中失调的328个基因（20.7%）也在这些数据库中有报道。在DISGENET中，我们发现有249个基因在多种神经系统疾病中显著富集（图4B和表S18）。这些疾病与在PACS1综合征患者中观察到的表型重叠，如自闭症谱系障碍（ASD）、智力障碍（ID）、癫痫和神经系统或面部特征的异常形态发生，以及与尚未报道的表型重叠，如神经退行性变。

有趣的是，PACS1综合征的核心神经发育特征，如智力障碍（ID）、语言迟缓和癫痫，在所有调控层面均被富集，而面部和肌肉异常则在蛋白质组和磷酸化蛋白质组中富集（即宽鼻梁、眼距过宽、肢体肌张力增高和步态不稳）。我们还鉴定出多个在PACS1(+/R203W)类器官中失调的基因，这些基因在OMIM中被报告为导致神经发育障碍（NDD），或在SFARI数据库中被列为自闭症谱系障碍（ASD）风险基因（图4C和4D及表S19）。在PACS1(+/R203W)类器官的成熟过程中，55个NDD基因和57个ASD基因出现失调（图4C），主要在磷酸化蛋白质组水平上。我们还鉴定出在特定发育时间节点跨调控层面失调的额外基因（194个NDD基因和98个ASD基因）（图4D）。这些结果强调了发育过程中基因调控机制的互补性，支持将蛋白质组分析纳入研究以扩展我们对NDD发病机制的理解。

讨论

NDD具有高度异质性，可源自数百个基因中的变异。多项局限性阻碍了我们对这些变异作用机制的理解，限制了遗传学发现向临床的转化。在此，我们利用蛋白质组学在脑类器官中的潜力，深入探究PACS1综合征的致病机制。蛋白质组学方法通常是bulk（整体）的，因此缺乏单细胞分辨率。因此，我们重新分析了转录组数据，采用全类器官伪bulk方法以更好地比较蛋白质组与转录组特征。重新捕捉的基因调控信号表明，两种方法在受影响的生物学过程之间具有高度一致性。尽管在PACS1(+/R203W)类器官中mRNA、蛋白质和磷酸化水平鉴定到的失调基因重叠度较低，但大多数失调过程呈现趋同。然而，PACS1(+/R203W)类器官还表现出时间依赖性调节蛋白的丰度和磷酸化动态失调，这些变化未被转录组学检测到，这凸显了用蛋白质组分析补充转录组学研究的重要性。同时针对蛋白质组和转录组学的实验方法有助于理解所鉴定到的失调基因身份之间的差异。

在转录组水平上，我们鉴定出许多与神经发生和突触功能相关的受影响过程，主要在成熟神经元中。蛋白质组数据不仅强化了这些过程对p.R203W发病机制的重要性，还检测到与已知PACS1功能相关的失调过程。例如，PACS1在蛋白质分选中的作用解释了囊泡相关过程的过度富集。此外，多个已确立的PACS1互作蛋白被发现为失调蛋白，例如其旁系同源基因PACS2。PACS1和PACS2在进化上是从古老的PACS基因在高等多细胞动物中通过基因重复产生的。PACS1功能主要涉及从高尔基体反面网络（tGN）从内体进行分选，而在PACS1(+/R203W)类器官中观察到超过20种蛋白质的时间依赖性失调。与此同时，PACS2进化出从高尔基体到内质网的货物分选功能以及对COPII囊泡被膜蛋白的偏好，这两个过程在PACS1(+/R203W)类器官中均上调。这些过程的上调与PACS2通过S437位点磷酸化增加而获得潜在调节功能一致，这有利于PACS2的转运功能。磷酸化PACS2的增加可能解释了PACS1(+/R203W)类器官中失调的蛋白质组特征所提示的囊泡运输和线粒体蛋白导入缺陷。相反，这也可能解释了凋亡信号通路基因的下调。需要设计功能实验来验证这些观察结果。值得注意的是，PACS2调控中间区域的一个反复发生的de novo错义突变与PACS2综合征相关，这是另一种NDD。未来旨在理解PACS1和PACS2功能相互联系及其在疾病中失调与补偿效应的基础研究，将有助于阐明PACS1和PACS2综合征的发病机制。

随时间推移失去下调的那些过程与近期描述的PACS1功能相关，包括通过与HDAC2、HDAC3和HDAC6相互作用维护基因组稳定性和DNA修复的相关蛋白（参考文献20、22）。尽管我们未观察到HDAC2、HDAC3或HDAC6的蛋白质丰度和磷酸化状态变化，但发现HDAC5在第40天下调，HDAC1在成熟过程中磷酸化降低。这表明PACS1也可能通过这些蛋白调节DNA稳定性。HDAC1与RB1和SMARCA4（两者在磷酸化水平上均失调）在静息神经元中以抑制性复合物形式相互作用。该复合物以钙依赖性方式被解离以允许转录，提示PACS1 p.R203W变异可能通过破坏HDAC1、RB1和SMARCA4形成的抑制性复合物而影响转录调控。我们课题组及其他研究组先前已报道过转录失调（参考文献）。然而，HDAC1、RB1和SMARCA4复合物是否在这些过程中发挥作用仍不清楚。

与已知PACS1功能无关的过程也出现了，例如在下调稳定簇中与核苷酸代谢和蛋白质翻译调节相关的富集。越来越多的证据表明蛋白质翻译对NDD发病机制的影响，包括ASD和脆性X综合征。旨在确认这些蛋白质翻译缺陷的功能研究将是合乎逻辑的下一步。这是首次将其中任何一个过程与PACS1综合征发病机制联系起来，因为这些过程未被转录组分析所识别。因此，这一结果凸显了在模拟NDD时从多个调控层面收集数据以获得致病机制更完整图景的重要性。

似乎与PACS1功能无关但在PACS1(+/R203W)类器官中表现上调的过程应进一步探索。鉴于现有证据表明PACS1 p.R203W致病变异可能导致功能获得（参考文献），对旨在抑制其毒性效应的靶向治疗策略的兴趣日益增加（参考文献）。因此，那些看似与PACS1功能无关但在PACS1(+/R203W)类器官中观察到上调的过程应成为关注重点。了解特定的蛋白质组失调是变异相关毒性所致还是维持细胞稳态的补偿机制将尤为重要。此外，我们发现在PACS1(+/R203W)类器官中失调的大部分基因也与NDD和ASD相关（参考文献）。然而，NDD和ASD相关基因的过度富集也可能反映了神经发育通路之间的相互联系。需要额外的机制分析来理解这些效应是直接还是间接的。

最后，PACS1 p.R203W变异似乎影响了每个调控层面，我们在与患者表现出的临床特征相关的过程中看到趋同现象。这包括ASD、ID和癫痫（参考文献），以及尚未报道的表型如神经退行性病变，均反映在mRNA和蛋白质丰度以及磷酸化状态的失调中。有趣的是，面部和肌肉异常，包括宽鼻梁、眼距过宽、肢体肌张力增高和步态不稳，主要源于蛋白质组和磷酸化蛋白质组中的富集。本研究为假设生成和设计旨在验证所提出致病机制的实验方法奠定了基础。我们的结果凸显了蛋白质组分析补充转录组研究以增强对NDD机制理解并发现可能促进治疗开发的额外治疗靶点的潜力。

研究局限性

尽管我们捕获了广泛的蛋白质和磷酸化肽段，在一定程度上重现了脑类器官中早期脑发育的方面，但该数据集并未完全代表神经发育的复杂性或时间动态。蛋白质组数据源自bulk组织，因此缺乏转录组方法的单细胞分辨率，限制了对这些技术的直接比较。同样，磷酸化肽段的发现需要进一步验证以确定其在PACS1 p.R203W发病机制中的机制作用。通路和生物学功能富集分析也受限于不完整的基因和通路注释。尽管这些分析对解读大型数据集很有用，但它们是描述性和相关性的，并不能建立因果关系。同样，伪时间分析是基于分子特征对细胞状态进行计算排序，而非发育时间的直接度量，因此应谨慎解读。最后，尽管脑类器官重现了人类脑发育的关键特征，但它们缺乏在发育后期才出现或源自其他胚层的细胞类型，包括星形胶质细胞和中胚层来源的小胶质细胞。这些细胞也可能对PACS1综合征的发病机制有贡献。因此，本研究所确定的机制应被视为未来研究的基础，而非疾病发病机制的全面描述。

资源可用性

主要联系人

请求进一步信息和资源的请求应发给主要联系人Alicia Guemez-Gamboa（[e-mail]），并将由她提供。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

• 原始TMT质谱数据已存入蛋白质鉴定数据库（PRIDE）公共库，项目登录号为PRIDE: PXD080130，项目链接为https://doi.org/10.6019/PXD080130。
• 本研究未报告原始代码。
• 重新分析本研究报道数据所需的任何附加信息可向主要联系人索取。

致谢

本研究部分得到北卡罗来纳大学Quest高性能计算设施提供的计算资源和人员贡献支持，该设施由教务长办公室、研究办公室和北卡罗来纳大学信息技术共同支持。

本工作由PACS1综合征研究基金会（A.G.-G.）资助，并由美国国立卫生研究院NINDS R01NS123163（A.G.-G.）以及NIMH R01MH125235（M.L.M.和B.D.）、R01MH118497（M.L.M.）资助。共聚焦显微镜实验在北卡罗来纳大学高级显微镜中心完成，由NCI CCSG P30 CA060553资助。

作者贡献

本工作由A.G.-G.构思。L.E.R.培养了类器官、收集样本并为蛋白质组分析做准备。S.R.、B.D.、J.G.和M.L.M.进行了样本的TMT质谱处理。X.G.-M.完成了转录组和蛋白质组分析的所有生物信息学步骤，A.W.协助处理图表，S.R.、B.D.和L.K.协助完善蛋白质组实验设计。A.W.、A.L.S.、J.R.、C.L.B.和T.A.S.进行了湿实验室实验（免疫组织化学、蛋白质印迹和成像）以及由此产生的数据分析。写作由X.G.-M.完成，并由A.G.-G.、M.L.M.、L.E.R.、J.R.、A.L.S.、T.A.S.和C.L.B.编辑。

所有作者均已阅读并批准最终稿件。

**利益声明**
作者声明不存在任何利益冲突。

**关于生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明**
作者在写作过程中未使用AI或AI辅助技术。

---

**STAR★方法**

**主要资源表**

**试剂或资源 | 来源 | 标识符**

**抗体**

抗Ctip2单克隆抗体（25B6）（推荐稀释比例1:500）— Abcam，货号：ab18465；RRID：AB_2064130

抗SOX2多克隆抗体（推荐稀释比例1:200）— MilliporeSigma，货号：AB5603；RRID：AB_2286686

抗Nestin抗体，克隆号10C2（推荐稀释比例1:1000）— MilliporeSigma，货号：MAB5326；RRID：AB_2251134

抗FOXG1抗体 [EPR18987]（推荐稀释比例1:100）— Abcam，货号：ab196868；RRID：AB_2892604

IRDye? 800CW 山羊抗兔IgG二抗 — LICORbio，货号：926–32211；RRID AB_621843

IRDye? 680RD 山羊抗小鼠IgG二抗 — LICORbio，货号：926–68070；RRID AB_10956588

IRDye? 800CW 山羊抗小鼠IgG二抗 — LICORbio，货号：926–32210；RRID AB_621842

驴抗小鼠IgG（H+L）高交联二抗，Alexa Fluor 594（推荐稀释比例1:200）— Thermo Fisher Scientific，货号：A-21203；RRID：AB_141633

驴抗小鼠IgG（H+L）高交联二抗，Alexa Fluor? Plus 488 — Thermo Fisher Scientific，货号：A32766TR；RRID：AB_2866493

**化学品、多肽及重组蛋白**

Matrigel hESC合格基质，无LDEV — Corning，货号：354277

DMEM/F-12（杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12）— Gibco，货号：11320033

Y-27632 2HCl — Selleck Chemicals，货号：S1049

Accutase — MilliporeSigma，货号：SCR005

甲醛 — MilliporeSigma，货号：158127

正常驴血清 — SouthernBiotech，货号：0030–01

牛血清白蛋白 — MilliporeSigma，货号：A2153

DAPI — Abcam，货号：ab285390

Fluoromount-G? 封片剂 — Thermo Fisher Scientific，货号：00–4958–02

PVDF转膜膜 — Thermo Fisher Scientific，货号：88518

Intercept封闭缓冲液 — LICORbio，货号：927–60001

Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂预混液（100×）— Thermo Fisher Scientific，货号：1861284

RIPA裂解缓冲液（10×）— EMD Millipore Corp，货号：20–1884

Laemmli样品缓冲液（4×）— Bio-Rad，货号：1610747

Pierce BCA蛋白测定试剂盒 — Thermo Fisher Scientific，货号：23225

**关键商业试剂盒**

STEMdiff? 背侧前脑类器官分化试剂盒 — STEM CELL Technologies，货号：08620

STEMdiff? 三胚层分化试剂盒 — STEM CELL Technologies，货号：05230

STEMdiff? 神经类器官维持试剂盒 — STEM CELL Technologies，货号：100–0120

mTeSR? 培养基 — STEM CELL Technologies，货号：05825

AggreWell?800 24孔板 — STEM CELL Technologies，货号：34811

STEMdiff 脑类器官成熟试剂盒 — STEM CELL Technologies，货号：08571

Costar超低黏附6孔板 — Corning，货号：3471

Axygen 200 mL大口径移液器吸头 — Corning，货号：TF-205-WB-R-S

37 μm可逆滤网，大号（50 mL）— STEM CELL Technologies，货号：27250

Micro BCA? 蛋白测定试剂盒 — Thermo Fisher Scientific，货号：23235

TMTpro? 16通道标记试剂套装 — Thermo Fisher Scientific，货号：A44520

Pierce? 高pH反相肽分级试剂盒 — Thermo Fisher Scientific，货号：84868

HALO 120 ? ELV C18 — HALO，货号：92272–402

AssayMAP 5 μL Fe(III)-NTA柱 — Agilent，货号：G5496-60085

Acclaim PepMap RSLC C18，2 μm，100 ?，75 μm内径×50 cm，nanoViper — Thermo Fisher Scientific，货号：164540

S-Trap? 微柱 — Protifi，货号：C02-MICRO-10

**沉积数据**

原始TMT质谱数据 — 本文 — PRIDE: PXD080130

单细胞测序数据 — Rylaarsdam等 — NCBI基因表达数据库（GEO）: GSE250386

人类胎儿脑蛋白质组 — Djuric等 — ProteomeXchange: PXD004076

**实验模型：细胞系**

对照细胞系1（+/+），女性（WT1）— Coriell — GM03651

CRISPR修正细胞系2（+/+），女性（WT2）— Rylaarsdam等 — PACS1002i-GM27159

CRISPR修正细胞系3（WT3），男性（WT3）— Rylaarsdam等 — PACS1003i-GM27161

对照细胞系4（WT4），男性（WT4）— Coriell — GM03652

对照细胞系5（WT5），女性（WT5）— Wicell — GM27160

CRISPR p.R203W插入（+/R203W），女性（P1）— Rylaarsdam等 — GM03651(+/R203W)

受累个体（+/R203W），女性（P2）— Wicell — PACS1002i-GM27159

受累个体（+/R203W），男性（P3）— Wicell — PACS1003i-GM27161

**软件和算法**

Proteome Discoverer 2.4 — Thermo Fisher Scientific — https://www.thermofisher.com/

R语言版本4.1.1 — R核心团队 — https://www.r-project.org

STEM v1.3.13 — Ernst和Bar-Joseph — https://doi.org/10.1186/1471-2105-7-191

limma v3.58.0 — Ritchie等 — https://doi.org/10.1093/nar/gkv007

Seurat v5.3 — Hao等 — https://doi.org/10.1038/s41587-023-01767-y

GeneOverlap v.1.40.0 — Shen等 — http://shenlab-sinai.github.io/shenlab-sinai/

UpSetR（v.1.4.0）— Gehlenborg — https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx364

DESeq2 v1.46 — Love等 — https://doi.org/10.1186/s13059-014-0550-8

Metascape v3.5.20240901 — Zhou等 — https://doi.org/10.1038/s41467-019-09234-6

Cytoscape v3.10.2 — Shannon等 — https://doi.org/10.1101/gr.1239303

webr v.0.1.5 — Moon等 — https://github.com/cardiomoon/webr

ggplot2 v3.5.1 — Wickham — https://github.com/tidyverse/ggplot2

Monocle3 — Cao等 — https://doi.org/10.1038/s41586-019-0969-x

---

**实验模型和受试参与者详情**

本研究按照相关伦理法规执行，并已获得西北大学机构审查委员会批准（IRB STU00215054）。源自人类诱导多能干细胞（iPSC）的细胞系已进行去标识化处理，不关联和/或无法获取供体信息。所有供体均同意将其组织用于研究目的。研究使用了女性和男性细胞系，但性别未被作为独立变量进行评估。PACS1综合征影响所有性别，且无证据表明疾病严重程度受性别影响。研究使用了来自25岁女性（WT1，GM03651）和24岁男性（WT4，GM03652）的2条对照细胞系，以及一名3岁PACS1综合征女儿（P2，PACS1002i-GM27159）的39岁未受累母亲（WT5，GM27160），以及另一名6岁男性患者（P3，PACS1003i-GM27161）。总共使用了3对等基因细胞对，其中p.R203W变异体被引入WT1背景中（P1），并在两条患者细胞系（P2和P3）中进行修正（WT2和WT3），如Rylaarsdam等人所述。所有细胞系的核型分析结果均为正常，并使用短串联重复序列（STR）分型进行鉴定。所有iPSC细胞系均表达多能性标志物，并使用STEMdiff?三胚层分化试剂盒（Stem Cell Technologies，05230）证明了分化成三个胚层的分化能力。所有细胞系定期检测支原体污染，并使用Sanger测序进行基因型鉴定。所有细胞系在3次独立试验中进行分化，每次至少有3个重复样本，在成熟第40天和第90天随机收集单个类器官。对于第21天收集的样本，由于体积较小，将同一次分化的多个类器官混合为一个样本。每条细胞系收集的样本总数如下：WT1，12个（第21天：5个，第40天：4个，第90天：3个）；P1，10个（第21天：4个，第40天：4个，第90天：2个）；WT2，8个（第21天：3个，第40天：3个，第90天：1个）；P2，7个（第21天：3个，第40天：3个，第90天：1个）；WT3，7个（第21天：3个，第40天：2个，第90天：2个）；P3，10个（第21天：4个，第40天：3个，第90天：3个）；WT4，9个（第21天：4个，第40天：3个，第90天：1个）；WT5，12个（第21天：2个，第40天：1个，第90天：1个）。更多样本信息参见表S20。

---

**方法详情**

**从iPSC生成前脑类器官**

三对等基因PACS1（+/+）和PACS1（+/R203W）iPSC细胞系此前已生成，并按照Sloan等人概述的方案使用试剂盒分化为脑类器官（Stem Cell Technologies，08620）。iPSC在mTeSR+培养基（Stem Cell Technologies，05825）中维持，培养于用Matrigel（Corning，354277）以10 μg/mL浓度溶解在DMEM/F12中预先包被的板上。干细胞的传代根据需要使用ReLeSR培养基（Stem Cell Technologies，05872）进行。准备AggreWell800 24孔板（Stem Cell Technologies，34811），每孔接种来自每条细胞系的300万个细胞。STEMdiff前脑类器官形成培养基更换5天，第6天将各AggreWell中的胚体通过37 μm滤网（Stem Cell Technologies，27250）过滤后，转移至含STEMdiff前脑类器官扩增培养基的6孔超低黏附板（Corning，3471）的两个孔中。每两天更换一次STEMdiff前脑类器官扩增培养基，直至第26天更换为STEMdiff前脑类器官分化培养基。类器官在分化培养基中培养至第43天。第43天后，类器官在STEMdiff前脑类器官维持培养基中培养直至收集。

**类器官冰冻切片和染色**

类器官用4%甲醛在4°C固定过夜，然后转移至30%蔗糖中至少16小时（4°C）。将类器官嵌入OCT中，在干冰和乙醇中快速冷冻，并存放在-80°C。冷冻类器官以15-20 μm厚度进行冰冻切片，干燥至少1小时后用PBS洗涤以去除OCT。抗原修复通过在pH 6.0的10 mM柠檬酸盐溶液中于99°C蒸汽处理10分钟完成。切片洗涤后在10% NDS、0.3% Triton X-100 PBS溶液中封闭，然后在4°C过夜孵育一抗。本研究使用的一抗包括：CTIP2（Abcam，ab18465，稀释比例1:200）；SOX2（EMD Millipore，稀释比例1:200）。过夜孵育后用PBS洗涤，在5% NDS、0.15% Triton X-100溶液中以1:200比例室温孵育二抗90分钟。本研究使用的二抗包括驴抗小鼠Alexa Fluor 488（Invitrogen）和驴抗大鼠Alexa Fluor 594（Invitrogen，A21209，批号2078918）。DAPI（2 μg/mL）孵育20分钟。用Fluoromount-G（Thermo Scientific，00–4958–02）封片，在Nikon W1旋转盘共聚焦显微镜或BZX710 Keyence落射荧光显微镜上进行成像。

**蛋白质组分析的样品制备**

通过超声破碎将类器官中的总蛋白提取至裂解缓冲液（1%十二烷基硫酸钠（SDS），125 mM三乙胺碳酸氢盐（TEAB），75 mM NaCl，Halt?蛋白酶和磷酸酶抑制剂）中。另外纳入两条对照细胞系的裂解样品以提高蛋白质检测率。质谱样本的详细描述参见表S20。

**质谱样品制备**

**蛋白提取和胰蛋白酶消化。** 通过超声破碎将类器官中的总蛋白提取至裂解缓冲液（1% SDS，125 mM TEAB，75 mM NaCl，Halt?蛋白酶和磷酸酶抑制剂）中。裂解液在4°C下以12,000 g离心15分钟进行澄清。另外纳入两条对照细胞系的裂解样品以提高蛋白质检测率。样品处理的每个阶段、TMT标记和质谱分析均使用不同的随机化区组，并根据基因型和时点平衡。按厂家说明（货号：23235，Thermo Fisher）使用microBCA法估算总蛋白含量。每个样品取20 μg总蛋白，用二硫苏糖醇（DTT）还原，碘乙酰胺（IAA）烷基化，按厂家方案在S-Trap（Protifi）上进行胰蛋白酶消化。

**TMT标记。** 样品首先分配至五组TMTPro16区块（plex）之一，使得每组plex在基因型和时点上保持平衡，且每组plex中顺序随机（表S21和S22）。每个plex中纳入来自两条额外年龄匹配的无等基因对的对照细胞系（WT4和WT5）的类器官样品，以提高肽段多样性捕获。然而，由于这些样品缺乏等基因p.R203W对应，后来从下游分析中排除。用于内部参考缩放（IRS）归一化的混合参考对照纳入每个plex中。这些参考对照通过将所有样品的裂解液等量混合、分别消化后分等份进行TMT标记制备。肽段消化物在20 μL 100 mM TEAB中复溶，并在室温下超声15分钟用于TMT标记。TMTPro试剂恢复至室温后溶解于20 μL Optima LC/MS级乙腈（ACN）中。将6 μL约59 mM TMTPro试剂按序加入20 μL复溶肽段中。所有TMT plex同时进行标记。对于参考对照，肽段复溶于80 μL中，共40 μL用12 μL TMTPro 134 N标记。标记在室温下振荡（400 rpm）进行90分钟。反应通过加入3 μL 5%羟胺/100 mM TEAB在室温下振荡15分钟淬灭（参考通道为6 μL）。每个plex中所有样品连同20 μg等份的标记混合对照进行混合，每个plex共320 μg TMT标记肽段，在真空浓缩仪中干燥。其中80 μg用于肽段/蛋白定量，240 μg用于磷酸肽富集。在进行肽段/蛋白定量之前，80 μg等份按厂家方案使用Pierce高pH反相分级试剂盒分为8份。所得分级液在速干仪中干燥，用3% ACN和0.1%甲酸复溶。

**磷酸肽富集。** 对于磷酸肽富集，240 μg TMT标记肽段等份用C18旋转柱脱盐。样品在300 μL缓冲液A（LC MS级水0.1% TFA）中复溶，加入2% ACN，超声10分钟。树脂通过在5,000 g离心2分钟进行填充，用300 μL ACN激活两次，用300 μL缓冲液A活化两次。肽段在3,000 g离心1分钟加载一次。柱用300 μL缓冲液A洗涤三次，用300 μL 5%甲醇缓冲液A洗涤两次。肽段用300 μL 50% ACN和0.1% TFA洗脱两次，在真空浓缩仪中干燥。磷酸肽使用AssayMAP Agilent Bravo仪器和Fe(III)-NTA IMAC树脂按厂家说明（Agilent，货号：G5496-60085）进行富集。肽段在210 μL 80% ACN和0.1% TFA中复溶，水浴超声10分钟，涡旋10分钟，快速离心。树脂用50% ACN和0.1% TFA预湿，并用平衡/洗涤缓冲液80% ACN和0.1% TFA平衡。样品装入注射器后分配至流出收集板。注射器用柱洗涤缓冲液洗涤后弃入废液，再用注射器洗涤缓冲液重复洗涤。洗脱缓冲液抽入注射器后分配至洗脱收集板。

磷酸肽以18 μL 1%氢氧化铵溶液洗脱，并用1.8 μL 20%甲酸酸化，随后进行如上所述的高pH反相分级，但浓缩为5个分级。MS数据采集与原始数据处理。对于肽段/蛋白定量，将TMT标记肽段（约1 μg）加载到加热的PepMap RSLC C18 2 μm、100 ?、75 μm × 50 cm色谱柱（Thermo Scientific）上，并在为每个高pH反相分级优化的180分钟梯度中进行洗脱。样品洗脱物通过电喷雾（2000 V）进入Thermo Scientific Orbitrap Eclipse质谱仪进行分析。MS1谱图以120,000的分辨率采集。MS2谱图在离子阱中以CID（35%）和质心模式采集。实时搜索（最大搜索时间=34 s；最大漏切=1；Xcorr=1；dCn=0.1；ppm=5）用于选择离子以进行同步前体选择MS3。MS3谱图在Orbitrap中以HCD（60%）采集，隔离窗口=0.7 m/z，分辨率为60,000，最大注入时间为400 ms。对于磷酸肽定量，将TMT标记磷酸肽富集物的4 μL（共20 μL中取出）加载到加热的PepMap RSLC C18 2 μm、100 ?、75 μm × 50 cm色谱柱（Thermo Scientific）上，在180分钟梯度中洗脱：1 min 2% B，5 min 5% B，160 min 25% B，180 min 35% B。样品洗脱物通过电喷雾（2000 V）进入Thermo Scientific Orbitrap Eclipse质谱仪进行分析。MS1谱图以120,000的分辨率采集。MS2谱图在Orbitrap中以HCD（38%）和质心模式采集，隔离窗口=0.4 m/z，分辨率为60,000，最大注入时间为350 ms。原始MS文件使用Proteome Discoverer版本2.4（Thermo Scientific，MA州Waltham）进行处理。MS谱图针对Homo sapiens Uniprot/SwissProt数据库进行搜索。使用SEQUEST搜索引擎（酶=胰蛋白酶，最大漏切=4，最小肽段长度=6，前体容忍度=10 ppm）。静态修饰包括羧基甲基化（C，+57.021 Da）和TMT标记（N端和K，TMTpro16为+304.207 Da）。动态修饰包括氧化（M，+15.995 Da）、磷酸化（S、T、Y，+79.966 Da，仅用于磷酸肽数据集）、乙酰化（N端，+42.011 Da）、Met丢失（N端，?131.040 Da）以及Met丢失+乙酰化（N端，?89.030 Da）。PSM通过Percolator节点过滤（最大Delta Cn=0.05，目标FDR（严格）=0.01，目标FDR（宽松）=0.05）。蛋白质通过最少1个唯一肽段和蛋白水平合并q值<0.05进行鉴定。报告离子定量基于校正后的S/N值，设置如下：积分容忍度=20 ppm，方法=最可靠的质心，共隔离阈值=70，SPS质量匹配=65。Western blot。使用1× RIPA缓冲液（EMD Millipore Corp，#20–188）和蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Scientific，#1861284）以1:100的比例从类器官中提取蛋白。类器官在此混合物中通过胰岛素注射器裂解，然后在冰上孵育5分钟。随后，样品在4°C下以10,000 × g离心10分钟，取上清液作为蛋白裂解液。使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（Thermo Scientific，#23225）对蛋白裂解液进行定量。然后将样品与制备好的4× Laemmli上样缓冲液（Bio-Rad，#1610747）混合，在95°C下煮沸10分钟。蛋白裂解液加载到SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转移到0.45 μm PVDF膜上（Thermo Scientific，#88518）。使用Protein Free Blocking Buffer（Li-Cor，#927–60001）封闭膜1小时，然后用含有一抗（按指示稀释度）、10 μL Tween 20和蛋白无封闭缓冲液的封闭液（总量5 mL）进行免疫印迹。膜在4°C下轻柔振荡孵育1-3夜。使用的一抗包括Nestin多克隆抗体（1:1000）、Anti-FOXG1抗体[EPR18987]（1:1000）和Anti-alpha Tubulin抗体[DM1A]（1:10,000）。一抗孵育后，用TBST洗涤三次，然后在室温下用含10 μL Tween 20、5 μL 10% SDS缓冲液和蛋白无封闭缓冲液的二抗液（总量5 mL）孵育1小时。二抗使用1:1000稀释，包括IRDye? 800CW山羊抗兔IgG二抗、IRDye? 680RD山羊抗小鼠IgG二抗和IRDye? 800CW山羊抗小鼠IgG二抗。孵育后，用TBST洗涤三次，然后使用Odyssey? Fc成像系统（Li-Cor）成像检测蛋白信号，并使用Image Studio（Li-Cor）进行定量。每个基因型使用了两个膜，每个膜包含两个重复样本。通过将各泳道信号与同一膜内α-Tubulin计算归一化因子进行标准化。WT中的标准化值按膜取平均值，然后使用相同的参考物计算p.R203W样本中的表达量倍数变化。倍数变化值经过log2转换以匹配蛋白质组学数据的尺度。生物信息处理。蛋白强度数据首先进行归一化，以调整每个TMT实验的每通道信号相等。使用合并参考样品计算每个TMT plex的缩放值和内部参考缩放（IRS）因子。随后进行中位数归一化并log2转换（图S4A和S4B）。对于同时定量了相应蛋白的肽段，还计算了磷酸化位点的相对占据率，方法是从log2标准化值中减去肽段丰度值。占据率和磷酸肽丰度均用于下游分析。进一步通过PCA分析表明，在图表的第二成分中存在与多重标记相关的批次效应（图S4C和S4D），我们在R包limma（v3.58.0）中通过为每个观察值计算重复相关性将plex作为批次进行建模，并包含协变量以适应limma模型（~ genotype + day + cell line），同时使用removeBatchEffect函数进行模型拟合的可视化。仅使用在所有plex中均存在且具有高检测/定位可信度的蛋白质和磷酸肽进行下游分析。实施此严格过滤是为了更好地控制批次效应，过滤性别依赖性蛋白质，并解决无法区分缺失值与非表达蛋白的问题。尽管采用此严格过滤，我们仍捕获到了与其他公开数据集相似的多样化蛋白质和磷酸肽池。时间序列聚类。我们使用了Short Time-series Expression Miner软件（STEM，v1.3.13），该软件基于总时间点数将数据集中的每个表达谱比较并分配到一组独立且具有代表性的时间表达谱模型中。这些模型谱与数据无关，对应于蛋白质表达量随时间变化的可能趋势。在实施过程中，将经过批次校正和归一化后的类器官蛋白丰度按同基因系和时间点取平均值。相同基因型、同基因系、时间点和分化阶段的样品取平均值，生成该组的代表性重复样本。然后，为STEM生成包含每种基因型、同基因系和分化组所有时间点的单一输入文件（图S9和表S23、S24）。我们还使用了Djuric等人先前报道的胎儿脑蛋白质组，并选取了所有报道脑区域（脑室区、中间区、下板区和皮层）的产前样本。胎儿脑样本以每个区域作为重复样本进行聚类。STEM算法将所有趋势转换为从0开始，为每个蛋白质生成一个向量（0，v1?v0，v2?v0，…，vn?v0）。然后根据相关系数将蛋白质分配到其时间序列最接近的模型谱中。每个模型谱分配的蛋白质数量与其预期分配数量进行统计显著性检验。预期数量的估计方法是随机打乱原始时间点，缩放蛋白质丰度，然后将其分配到最接近的模型谱中。所有置换后分配到每个模型谱的平均蛋白质数作为预期基因分配数量的估计值。此过程在Bonferroni校正p值的显著性水平0.05下进行。各参数使用的值见表S25。进行了多次初步运行以选择既提供大多数蛋白质聚类和谱多样性、又控制高度相似谱数量的参数值。使用GeneOverlap（v.1.40.0）和UpSetR（v.1.4.0）包进行已分析数据集间的蛋白质重叠分析。转录组假批量和细胞谱系假时间分析。重新分析了已发表的PACS1综合征单细胞数据以量化假批量基因表达谱。首先使用标准Seurat命令（v5.3）进行归一化，然后使用DESeq2（v1.46）按类器官样品聚合计数矩阵（每组类器官数量：WT D40 = 2，p.R203W D40 = 3，WT D90 = 2，p.R203W D90 = 2）。使用似然比检验，以类器官年龄和基因型的交互设计模型为完整模型测试成熟过程中的效应，以无交互项的缩减模型进行比较。为了比较假时间跨度的细胞类型谱系，将所有基因型下采样为每个类器官10,000个随机选择的细胞，并使用monocle3计算从前体细胞向神经元谱系转变的转录组景观。使用单侧Kolmogorov-Smirnov检验通过比较假时间值的分布来检验p.R203W轨迹是否比对照加速（图S4）。此前已评估了基因型间的细胞类型比例，无显著差异。功能过程——基因富集分析。使用在线工具Metascape（v3.5.20240901）进行富集检验，采用超几何检验后进行Benjamini-Hochberg p值校正，在?1.3 Log(q-value)以下的截断值选择统计学显著项，然后在R中使用rrvgo（v1.16）简化结果列表中的冗余。使用Gene Ontology（GO）生物学过程和基因-疾病关联（DisGeNET）数据库进行富集检验。使用webr（v.0.1.5）和ggplot2函数（v3.5.1）进行可视化。在Metascape中使用默认设置和人类基因组作为参考背景进行GO术语网络分析。简言之，从每个失调表达趋势中选择20个最高得分的聚类（最低p值），然后使用Kappa相似性统计量>0.3连接相似术语。结果网络在Cytoscape（v3.10.2）中编辑。此外，我们查阅了SFARI Gene数据库（2024年Q3版本）和OMIM，以检测已被注释为ASD风险基因和/或这些基因上的致病性变异导致NDD的失调蛋白质。定量与统计分析。本研究的目标是通过研究脑类器官成熟过程中的蛋白质组学景观调控，进一步了解PACS1综合征的致病机制。我们使用串联质谱标签（TMT）质谱技术对来自对照和携带独特PACS1 p.R203W变异的iPSC系生成的脑类器官进行分析。在21天、40天和90天收集类器官以更好地理解成熟过程。蛋白质和磷酸化肽段通过质谱进行处理。输出结果在R中使用IRS缩放进行归一化。处理后的输出结果被拟合到线性模型中，使用limma包测试成熟过程中的差异表达，以基因型作为固定效应，将天数和同基因系作为协变量进行校正，并计算重复相关性以建模plex（批次）。归一化数据还按同基因对进行汇总（表S20），并导入短时间序列（STEM）流程进行表达趋势聚类（图S9）。补充信息（24）下载全部PDF（2.00 MB）文档S1：图S1–S9和表S5、S25，以及数据S1电子表格（431.78 KB）表S1：类器官中检测到的蛋白质列表电子表格（242.11 KB）表S2：WT基因型类器官的聚类（蛋白质）电子表格（51.07 KB）表S3：WT类器官中富集的GO术语（蛋白质）电子表格（174.40 KB）表S4：胎儿脑样本的聚类（蛋白质）电子表格（90.76 KB）表S6：按天差异表达的蛋白质电子表格（20.89 KB）表S7：PACS1 p.R203W类器官中按天富集的GO术语电子表格（257.45 KB）表S8：

p.R203W 基因型类器官的聚类（蛋白质）电子表格 (58.31 KB)
表 S9. p.R203W 类器官中的失调聚类（蛋白质）电子表格 (12.85 KB)
表 S10. PACS1 p.R203W 类器官中富集的 GO 术语（蛋白质）电子表格 (601.48 KB)
表 S11. 类器官中检测到的肽段列表电子表格 (350.55 KB)
表 S12. WT 基因型类器官的聚类（磷酸化位点）电子表格 (362.27 KB)
表 S13. p.R203W 基因型类器官的聚类（磷酸化位点）电子表格 (81.36 KB)
表 S14. p.R203W 类器官中的失调聚类（磷酸化位点）电子表格 (13.85 KB)
表 S15. 具有已报道功能的磷酸化位点电子表格 (21.74 KB)
表 S16. PACS1 p.R203W 类器官中富集的 GO 术语（磷酸化位点）电子表格 (56.81 KB)
表 S17. 重新分析的单细胞 RNA 测序中按天划分的差异表达基因电子表格 (13.92 KB)
表 S18. Disgenet 基因 - 疾病关联富集电子表格 (55.81 KB)
表 S19. OMIM NDD 和 SFARI ASD 风险相关基因电子表格 (16.08 KB)
表 S20. 类器官样本信息电子表格 (2.50 MB)
表 S21. 类器官中的 Log2 标准化数据（蛋白质）电子表格 (3.71 MB)
表 S22. 类器官中的 Log2 标准化数据（肽段）电子表格 (1.22 MB)
表 S23. 类器官中的 Log2 标准化数据（蛋白质），分组用于 STEM 流程电子表格 (1.54 MB)
表 S24. 类器官中的 Log2 标准化数据（肽段），分组用于 STEM 流程