NPC1L1介导胆固醇非囊泡转运的双重功能：胆固醇捕获与调控内膜叶胆固醇可及性

《iScience》：Dual functions of NPC1L1 for cholesterol transport: Cholesterol capture and regulation of inner-leaflet cholesterol accessibility

　　

尼曼-匹克C1样蛋白1（NPC1L1）对肠道胆固醇吸收至关重要，但其介导非囊泡胆固醇转运的详细机制仍不清楚。利用荧光胆固醇探针，研究人员发现NPC1L1以依折麦布敏感的方式降低了外膜叶的可及性胆固醇，同时增加了内膜叶的可及性胆固醇。这一活性不依赖于外膜叶鞘磷脂水平，也不受N端结构域（NTD）的功能障碍突变影响，该结构域负责介导细胞外胆固醇结合并插入到外膜叶。相反，固醇感知结构域（SSD）的突变消除了NPC1L1依赖性的质膜膜叶间可及性胆固醇再分布。这些发现支持一个两步模型：NTD捕获胆固醇并将其插入外膜叶，而SSD促进胆固醇向内膜叶的再分布。本研究识别了NPC1L1介导的非囊泡胆固醇转运中一个先前未被认识的步骤，并为SSD功能提供了机制性见解。

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一、研究背景与目的

胆固醇是机体必需分子，但血液胆固醇升高是动脉粥样硬化和心肌梗死等心血管事件的危险因素。维持胆固醇稳态的关键环节之一是膳食胆固醇的吸收。2004年，Altmann等人报道，在尼曼-匹克C1（NPC1）样蛋白1（NPC1L1）基因敲除小鼠中，胆固醇吸收降低约70%，表明NPC1L1在肠道胆固醇吸收中发挥核心作用。此外，NPC1L1是临床降脂药依折麦布（ezetimibe）的靶蛋白。

从结构上看，NPC1L1含有一个固醇感知结构域（sterol-sensing domain，SSD），这是一个与其他胆固醇代谢关键调节因子（如NPC1和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶）共有的高度保守跨膜区域。尽管NPC1L1已在囊泡内吞胆固醇摄取背景下被广泛研究，但近期研究揭示了其在非囊泡胆固醇摄取中的额外作用。然而，细胞外胆固醇在非囊泡过程中如何穿过质膜（plasma membrane，PM）的详细机制仍不清楚，尤其是SSD在此过程中的角色。

近年研究发现，细胞膜中的胆固醇可根据其与其他脂质和蛋白质的相互作用分为两种生化状态：“可及性胆固醇”（accessible cholesterol），可自由与蛋白质相互作用；“不可及性胆固醇”（inaccessible cholesterol），被鞘磷脂等膜磷脂隔离。其中，可及性胆固醇对于通过细胞内脂质转运蛋白（如氧化甾醇结合蛋白相关蛋白和GRAMD家族蛋白）进行的细胞器间胆固醇转运至关重要。

利用产气荚膜梭菌溶血素O（perfringolysin O，PFO）的结构域4（domain 4，D4）及其突变体D4H（D434S，对胆固醇亲和力更高）作为胆固醇探针，已能分别可视化并定量质膜外膜叶和内膜叶中的可及性胆固醇。虽然胆固醇能在脂双层中快速自发翻转，但近期研究表明，固醇外排转运蛋白和质膜磷脂含量仍可在质膜内建立不对称胆固醇分布。事实上，多项基于D4探针的研究显示，哺乳动物细胞质膜外膜叶的胆固醇水平通常高于内膜叶。

基于此背景，研究人员假设：在胆固醇吸收过程中，从质膜到细胞内细胞器的有效非囊泡转运需要胆固醇在质膜膜叶之间的再分布，从而增加其对细胞内蛋白质（细胞器）的可及性。因此，研究人员探究了NPC1L1是否影响质膜外膜叶和内膜叶之间可及性胆固醇的分布。

二、研究方法概述

研究人员采用的主要关键技术方法包括：

1. 1.
   荧光胆固醇探针技术：使用纯化的重组mCherry标记的D4蛋白（mCherry-D4）和GFP标记的D4蛋白（GFP-D4）可视化质膜外膜叶的可及性胆固醇；通过转染mCherry-D4H表达载体可视化内膜叶的可及性胆固醇，并采用另一种内膜叶探针GFP-GRAM-W进行验证。
2. 2.
   荧光显微镜成像与定量分析：使用荧光显微镜（BZ-X800）采集图像，利用Cellpose软件进行细胞分割，通过Fiji图像分析软件量化质膜及全细胞的荧光强度，计算质膜荧光比值等参数。
3. 3.
   胆固醇摄取测定：采用[3H]胆固醇标记的混合微团进行胆固醇摄取实验，评估NPC1L1及其突变体的胆固醇摄取活性。
4. 4.
   位点定向诱变：构建多种NPC1L1突变体，包括N端结构域（NTD）功能障碍突变（L216A）、固醇感知结构域（SSD）突变（L649R和G652A+S653A）以及内吞缺陷突变（Y1306A）。
5. 5.
   鞘磷脂可视化：使用纯化的mCherry标记的非毒性溶细胞素（mCherry-NT-Lys）探针检测质膜外膜叶的鞘磷脂分布。
6. 6.
   Western印迹与细胞表面生物素化测定：验证各突变体NPC1L1的总蛋白表达水平和质膜定位。
7. 7.
   RNA干扰：在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中使用两种siRNA（siNPC1L1 #1和siNPC1L1 #2）敲低内源性NPC1L1表达，并通过实时定量PCR和Western印迹确认敲低效率。
8. 8.
   细胞系：主要使用大鼠肝癌细胞系McA-RH7777进行过表达研究，并使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231研究内源性NPC1L1功能。

三、研究结果

1. 在McA-RH7777细胞中过表达NPC1L1增加胆固醇摄取

通过微团胆固醇摄取实验证实，在McA-RH7777细胞中表达NPC1L1可增加胆固醇摄取，且该增加可被依折麦布抑制。

2. D4和D4H可作为McA-RH7777细胞中的胆固醇探针

纯化的mCherry-D4和GFP-D4蛋白可特异性标记质膜外膜叶的可及性胆固醇，而mCherry-D4H可在细胞内表达后标记内膜叶的可及性胆固醇，两者信号均可被甲基-β-环糊精耗竭胆固醇所消除。

3. NPC1L1降低质膜外膜叶的可及性胆固醇

与对照GFP表达细胞相比，NPC1L1表达细胞中mCherry-D4的荧光强度显著降低，表明外膜叶可及性胆固醇减少。这种降低可被依折麦布以浓度依赖性方式逆转，且短时间（1小时）处理即可生效，提示效应是直接的而非间接。

4. NPC1L1增加质膜内膜叶的可及性胆固醇

使用mCherry-D4H探针，NPC1L1表达细胞显示出更高的质膜荧光比值（质膜荧光强度/全细胞荧光强度），表明内膜叶可及性胆固醇增加。该效应同样被依折麦布抑制。使用另一种内膜叶探针GFP-GRAM-W也得到了一致的结果。

5. NPC1L1调控质膜膜叶间的可及性胆固醇分布

同时应用GFP-D4和mCherry-D4H探针的实验进一步证实，NPC1L1表达导致外膜叶可及性胆固醇减少和内膜叶可及性胆固醇增加，这种再分布效应可被依折麦布阻断。

6. NPC1L1对质膜外膜叶鞘磷脂分布的影响极小

使用mCherry-NT-Lys探针检测发现，NPC1L1表达细胞与对照细胞的质膜外膜叶鞘磷脂水平无显著差异，表明NPC1L1介导的可及性胆固醇分布变化并非由鞘磷脂改变所致。

7. NPC1L1的NTD几乎不参与调控质膜膜叶间的可及性胆固醇分布

表达NTD功能障碍突变体NPC1L1^L216A的细胞与表达野生型（WT）NPC1L1的细胞相比，在外膜叶可及性胆固醇减少和内膜叶可及性胆固醇增加方面均无显著差异，表明NTD在该调控过程中作用微小。

8. NPC1L1的NTD将细胞外胆固醇插入质膜外膜叶

当与胆固醇微团共孵育后，NPC1L1^WT表达细胞的外膜叶可及性胆固醇增加，而NPC1L1^L216A表达细胞则无此反应，且依折麦布可部分抑制该增加。这表明NTD负责捕获细胞外胆固醇并将其插入外膜叶。

9. NPC1L1的SSD调控质膜膜叶间的可及性胆固醇分布

与NPC1L1^WT相比，表达SSD突变体（NPC1L1^L649R和NPC1L1^G652A+S653A）的细胞在外膜叶表现出更高的可及性胆固醇水平，而在内膜叶表现出更低的质膜荧光比值。这表明SSD在调控可及性胆固醇的膜叶间分布中起关键作用。

10. NPC1L1的囊泡内吞并非调控质膜膜叶间可及性胆固醇分布所必需

表达内吞缺陷突变体NPC1L1^Y1306A的细胞在调控外膜叶和内膜叶可及性胆固醇方面与NPC1L1^WT表现一致，且该效应仍对依折麦布敏感。值得注意的是，在该实验系统中，NPC1L1^Y1306A仍保留了与WT相当的依折麦布敏感性胆固醇摄取活性，这可能反映了非囊泡途径的相对贡献更大。

11. 内源性NPC1L1在MDA-MB-231细胞中调控质膜膜叶间的可及性胆固醇分布

在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中，依折麦布处理或使用两种siRNA敲低内源性NPC1L1，均导致外膜叶可及性胆固醇增加和内膜叶可及性胆固醇减少，与过表达系统的结果一致，验证了内源性NPC1L1在生理条件下的功能。

四、讨论与结论

讨论部分总结：本研究首次证明NPC1L1不仅导入细胞外胆固醇，还控制质膜脂双层间的可及性胆固醇分布。研究发现NPC1L1对鞘磷脂分布影响极小，表明它是一种独立于鞘磷脂的新型胆固醇分布调控因子。此前已知ABCA1和ABCG1促进胆固醇从内膜叶向外膜叶再分布以维持不对称性，而本研究发现NPC1L1是首个能增加内膜叶可及性胆固醇的调控因子。

研究提出一个两步工作模型：NTD直接结合细胞外胆固醇并将其插入质膜外膜叶；SSD增加内膜叶胆固醇可及性，可能为后续由GRAMD1s等胞内脂质转运蛋白将胆固醇转运至内质网提供支持。SSD突变（L649R和G652A+S653A）改变了可及性胆固醇的膜叶间分布，这与之前冷冻电镜结构分析中揭示的SSD隧道结构与胆固醇直接结合的发现一致，表明SSD对胆固醇的识别是NPC1L1调控质膜胆固醇可及性所必需的。

关于依折麦布的作用机制，研究发现它既抑制NTD介导的胆固醇捕获/插入过程，又完全取消NPC1L1对膜叶间可及性胆固醇分布的调控，且后者效应更为显著。结合冷冻电镜分析显示依折麦布结合位点位于质膜外膜叶附近并可诱导包括SSD在内的跨膜区构象变化，提示依折麦布可能主要通过改变SSD及相关胆固醇结合区域的构象来抑制NPC1L1的功能。

此外，内吞缺陷突变体NPC1L1^Y1306A仍能正常调控可及性胆固醇分布，表明该过程在很大程度上独立于经典的内吞途径。在MDA-MB-231乳腺癌细胞中发现内源性NPC1L1调控胆固醇分布，且依折麦布已被报道抑制该细胞的迁移和侵袭，提示NPC1L1调控的膜胆固醇动态可能在癌症等疾病中具有病理生理学意义。

研究结论翻译：总之，本研究提示NPC1L1以依折麦布敏感的方式调控质膜膜叶间的胆固醇可及性。研究人员进一步发现，NPC1L1的NTD参与捕获细胞外（微团）胆固醇并将其插入质膜外膜叶，而NPC1L1的SSD则在随后的可及性胆固醇跨膜叶分布调控中发挥重要作用。这些发现支持一个模型：NPC1L1介导的非囊泡胆固醇摄取涉及两个不同功能域的协同作用，它们以逐步方式运作。本研究有助于深入理解NPC1L1介导胆固醇转运的机制以及依折麦布的药理作用，并为理解功能尚不明确的SSD的生理功能提供了重要的新见解。