《Microbiology Spectrum》：A comparative study of mNGS and tNGS for pathogen detection in paired upper and lower respiratory tract specimens from pediatric pneumonia patients
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高通量测序技术已成为临床诊断的重要工具，但靶向二代测序（tNGS）与宏基因组二代测序（mNGS）在儿童呼吸道感染中的比较性能尚不明确。本研究收集下呼吸道感染患儿的配对咽拭子与支气管肺泡灌洗液（BALF）标本，并同时采用tNGS与mNGS对配对标本进行病原检测。
高通量测序技术已成为临床诊断的重要工具，但靶向二代测序（tNGS）与宏基因组二代测序（mNGS）在儿童呼吸道感染中的比较性能尚不明确。本研究收集下呼吸道感染患儿的配对咽拭子与支气管肺泡灌洗液（BALF）标本，并同时采用tNGS与mNGS对配对标本进行病原检测。对于同一标本类型，tNGS与mNGS表现出高度一致性，BALF的Kappa系数为0.791（P < 0.001），咽拭子为0.757（P < 0.001）。尽管上呼吸道与下呼吸道的病原谱存在差异，但在采用相同检测方法时，两个解剖部位间的一致性仍较为显著，mNGS的Kappa值为0.659（P < 0.001），tNGS为0.590（P < 0.001），两者均接近或达到强一致性的阈值。上述发现证实，tNGS可作为mNGS在儿童呼吸道病原检测中的可靠替代方案，且即使在不同呼吸道部位之间，其诊断一致性也足以支持临床决策。
研究背景与意义
呼吸道感染长期以来是全球重大公共卫生挑战，其疾病负担超过肿瘤和心血管疾病。多种病原体可引起呼吸道疾病，常导致单一或混合感染，使病情复杂化并显著威胁患者安全。儿童呼吸道感染的临床结局通常较成人更为严重。全球疾病负担（GBD）2021研究显示，2021年肺炎链球菌感染在全球五岁以下儿童中造成约179,354例死亡；世界卫生组织（WHO）报告指出，肺炎和腹泻合计在2021年导致约117万五岁以下儿童死亡，占该年龄组儿童死亡总数的23%。儿童呼吸道感染多发于秋冬季节，流行病原谱相对稳定，但COVID-19疫情后，儿童呼吸道病毒感染的流行病学特征出现显著变化，包括流行季节时间及循环病原多样性的改变。这些变化凸显了快速、准确诊断工具的迫切需求。
二代测序（NGS）技术无需预先培养即可全面鉴定感染病原体，较传统培养方法具有更高灵敏度，符合精准医学理念。宏基因组二代测序（mNGS）采用“鸟枪法”对样本中所有核酸进行无偏测序，已被证明优于传统培养方法，并能在血浆中首次检出某些罕见病原体。靶向二代测序（tNGS）作为新兴技术，通过多重PCR或探针捕获策略仅富集并测序预设的病原靶基因，具有成本更低、特定靶标灵敏度更高的潜在优势，但其在儿童呼吸道感染中的比较性能尚待充分阐明。为此，昆明市儿童医院开展本研究，比较mNGS与tNGS在儿童呼吸道感染中的病原检测能力，为优化方法选择、支持临床决策和促进精准诊断提供依据。
研究设计与方法
研究人员从昆明市儿童医院呼吸科纳入18例2023年住院的肺炎患儿，每例患儿同时采集咽拭子和支气管肺泡灌洗液（BALF）配对标本，分别进行mNGS和tNGS检测。tNGS检测面板覆盖475种病原微生物、88种耐药基因、150个基因变异和9个高毒力基因。研究人员对测序数据进行湿实验和生信双重质量控制，由临床微生物专家和呼吸科医师结合临床症状和用药史确定最终报告。采用Kappa统计评估mNGS与tNGS之间以及上下呼吸道标本之间病原检出的一致性。
研究结果
患儿临床特征
18例患儿中位年龄为6.5岁（四分位距：3.2–8.3岁），66.7%为女性。测序前94.4%接受过糖皮质激素治疗，72.2%接受过经验性抗生素治疗。15例临床诊断为大叶性肺炎，3例为支气管肺炎。
mNGS或tNGS检出的上下呼吸道样本病原微生物分布
mNGS和tNGS在BALF和咽拭子标本中共检出81次细菌和113次病毒，病毒检出次数多于细菌。支原体被检出49次，真菌仅检出2次。18例样本均检出一种以上病原体。在BALF中，mNGS检出24种病原微生物，以肺炎支原体、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌最常见；tNGS检出23种病原体，以肺炎支原体、肺炎链球菌和人疱疹病毒7型（HHV-7）最常见。在咽拭子中，mNGS检出20种病原体，以肺炎支原体、HHV-7和流感嗜血杆菌为主；tNGS检出19种病原体，以肺炎支原体、HHV-7和肺炎链球菌检出率最高。
mNGS与tNGS病原诊断一致性
在BALF中，mNGS和tNGS对多种病毒（如细小病毒、人疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒和鼻病毒）及细菌（如卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌和肺炎支原体）表现出显著一致性，总体Kappa值为0.791（P < 0.001），属高度一致。在咽拭子中，博卡病毒、人疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒和肠道病毒的病毒一致性显著，金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌的细菌一致性也较高，总体Kappa值为0.757（P < 0.001）。
配对呼吸道样本经mNGS和tNGS检测的诊断一致性
采用mNGS时，BALF检出的病原体多于咽拭子，肺炎支原体和流感嗜血杆菌在两种标本中均最常见。多数病毒的上下呼吸道一致性显著，仅人疱疹病毒一致性较差；肺炎克雷伯菌、肺炎支原体和流感嗜血杆菌的细菌一致性较高。BALF与咽拭子总体Kappa值为0.659（P < 0.001），属显著一致。采用tNGS时，BALF检出病原体同样多于咽拭子，肺炎支原体和肺炎链球菌最常见。博卡病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和肠道病毒的病毒一致性较强，流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的细菌一致性较高。BALF与咽拭子总体Kappa值为0.590（P < 0.001），同样达到显著一致水平。
讨论与结论
既往研究已报道tNGS对下呼吸道感染的诊断效能与mNGS相当，且在真菌检测方面具有优势，支持其作为经济有效的选择；另有研究显示tNGS与mNGS在不同标本类型中的微生物检出率无显著差异。本研究结果与之一致。tNGS通过特异性引物富集靶标病原基因，减少测序数据量，提高选定靶标的灵敏度并降低成本，弥补了mNGS成本高、宿主核酸占比高、DNA/RNA同步检测困难等局限。一项针对190例疑似下呼吸道感染癌症患者的回顾性研究显示，tNGS检出率显著高于传统微生物培养，且67.4%的患者仅通过tNGS检出阳性，41例患者依据tNGS结果调整了抗生素治疗，凸显其临床价值。
上下呼吸道感染常存在双重部位共感染及病原体在上下呼吸道间易位的现象。中国2009–2020年全国调查显示总体共感染率为23.3%，儿童中最高达34.3%。考虑到BALF采样在儿童中的侵入性，研究人员评估了咽拭子与BALF的诊断一致性：mNGS的Kappa值为0.659，tNGS为0.590，均达到或接近强一致性范围（0.61–0.80）。对于呼吸道合胞病毒、流感病毒等病原体，咽拭子提供极佳的一致性；对于肺炎支原体、铜绿假单胞菌等主要定植于下呼吸道的细菌，一致性仍显著，但咽拭子阴性结果需谨慎解读。上呼吸道标本在常规临床场景中可作为微创采样选项提供参考性病因信息，但下呼吸道采样仍是明确诊断的金标准，尤其在复杂或重症病例中。
研究结论：对于同一标本类型，tNGS与mNGS达到显著一致性（Kappa = 0.791和0.757），支持tNGS作为经济有效的病原检测替代方案。更重要的是，尽管上下呼吸道病原谱存在差异，咽拭子与BALF的诊断一致性同样显著（mNGS Kappa = 0.659，tNGS Kappa = 0.590），接近强一致性范围。上呼吸道标本可为大多数常见儿童呼吸道病原体提供有参考价值的诊断数据，有助于减少临床实践中对侵入性BALF采样的依赖。tNGS在常规病原筛查中具有良好的实用性和效率，而mNGS在儿童呼吸道感染中鉴定未知、非典型或罕见病原体方面仍保有独特价值。
