靶向ZMYND8解除IL-2信号抑制以逆转T细胞耗竭

《Nature》：Targeting ZMYND8 unleashes IL-2 signalling to override T cell exhaustion

　　

CD8⁺ T细胞耗竭阻碍慢性病毒感染和癌症的控制。这种低功能状态的特征是高亲和力IL-2受体（IL-2R）和STAT5信号的下调，以及从 progenitor exhausted T cells（Tex_prog cells）向终末耗竭T细胞而非细胞毒性效应样细胞的分化。介导IL-2R–STAT5信号衰减和效应样细胞分化丧失的表观遗传机制和调控网络仍然未知。本研究利用体内单细胞CRISPR筛选（single-cell CRISPR screens）靶向表观遗传因子和IL-2信号调控因子，揭示染色质阅读器ZMYND8拮抗IL-2R–STAT5信号，从而抑制效应样状态并促进终末耗竭。ZMYND8表达由慢性抗原刺激上调，靶向CD8⁺ T细胞中的ZMYND8促进了中间耗竭T细胞（Tex_int cells）和杀伤细胞凝集素样受体表达耗竭T细胞（Tex_KLR cells）的积累。相应地，ZMYND8缺陷的CD8⁺ T细胞表现出显著改善的抗病毒和抗肿瘤效果，尤其是与IL-2治疗或免疫检查点阻断联合使用时。机制上，ZMYND8结合于Il2ra基因座上被组蛋白乙酰转移酶p300共占位的活性增强子区域，并抑制p300活性。p300的共缺失逆转了ZMYND8缺陷细胞中IL-2R表达增加和效应样细胞分化，表明ZMYND8抑制p300介导的转录激活以削弱IL-2R–STAT5信号。这些发现确立了一个表观遗传变阻器，施加“信号1”（慢性抗原刺激）诱导的“信号3”（IL-2信号）抑制以强制T细胞耗竭，而ZMYND8缺失则释放效应样状态而非终末耗竭状态，并增强免疫治疗效果。

**靶向ZMYND8解除IL-2信号抑制以逆转T细胞耗竭——论文解读**

**研究背景与科学问题**

慢性病毒感染和肿瘤微环境中的持续抗原暴露会诱导CD8⁺ T细胞进入耗竭状态，这一过程由转录因子TOX驱动，并构成免疫治疗的主要障碍。耗竭T细胞（Tex cells）呈现异质性，包含祖细胞样耗竭T细胞（Tex_prog cells）、中间耗竭T细胞（Tex_int cells）、杀伤细胞凝集素样受体表达耗竭T细胞（Tex_KLR cells）和终末耗竭T细胞（Tex_term cells）。其中，Tex_prog cells对免疫检查点阻断（ICB）有应答，可短暂分化为具有增强细胞毒功能的效应样细胞，随后进一步分化为Tex_term cells。耗竭状态伴随着高亲和力IL-2受体亚基IL-2Rα（CD25）表达的进行性下降，导致IL-2结合不充分和STAT5激活不足，进而促进耗竭。然而，介导IL-2R–STAT5信号衰减和效应样细胞分化丧失的表观遗传机制与调控网络尚不清楚。识别促进效应样细胞积累或将分化导向Tex_KLR而非Tex_term状态的机制，可能释放针对慢性感染和肿瘤的保护性免疫。

**研究内容与主要发现**

研究人员利用体内单细胞CRISPR（scCRISPR）筛选和批量CRISPR筛选，在表达Cas9的P14细胞（针对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）克隆13（Cl13）的特异性CD8⁺ T细胞）中系统靶向91个表观遗传因子和9个已知调控Tex分化的转录因子。通过单细胞转录组分析、ATAC–seq、CUT&RUN、单细胞多组学、流式细胞术及多种功能性实验，研究人员鉴定出染色质阅读器ZMYND8作为IL-2R–STAT5信号的负调控因子和终末耗竭的关键驱动因素。ZMYND8缺陷促进了效应样细胞（尤其是Tex_KLR cells）的积累，减少了Tex_term cells的形成，并增强了CD8⁺ T细胞的细胞毒功能和抗病毒、抗肿瘤能力。机制研究表明，ZMYND8通过其组蛋白阅读器结构域结合于Il2ra基因座的活性增强子区域，抑制组蛋白乙酰转移酶p300的活性，从而限制IL-2Rα表达和下游STAT5信号。p300共缺失可逆转ZMYND8缺陷引起的表型变化，证明ZMYND8–p300轴在调控IL-2R表达和效应样分化中发挥关键作用。此外，慢性抗原刺激会上调ZMYND8表达，而ZMYND8缺陷与IL-2治疗或ICB联合使用可协同增强抗肿瘤疗效。该研究揭示了慢性抗原刺激（信号1）通过ZMYND8介导的表观遗传变阻器抑制IL-2信号（信号3）从而强制T细胞耗竭的新机制，为改善免疫治疗提供了潜在靶点。

**关键技术与方法**

本研究主要采用了以下核心技术：（1）体内单细胞CRISPR筛选和批量CRISPR筛选，用于鉴定调控Tex异质性的表观遗传因子；（2）单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞多组学（单细胞ATAC+基因表达）分析，用于解析细胞状态和染色质可及性；（3）ATAC–seq和CUT&RUN assay，用于分析染色质开放性和转录因子/组蛋白修饰的基因组占位；（4）小鼠LCMV Cl13慢性感染模型及B16-gp33/B16F10肿瘤模型，用于评估抗病毒和抗肿瘤免疫效果；样本包括来自LCMV Cl13感染小鼠的P14细胞、B16肿瘤模型中的肿瘤浸润淋巴细胞、人源CD8⁺ T细胞（来自健康供者）以及已发表的HIV患者和癌症患者公共数据集。

**研究结果分述**

**Tex表观遗传基因调控网络**：通过scCRISPR筛选和单细胞转录组分析，研究人员鉴定了四个Tex细胞状态（Tex_prog、Tex_int、Tex_KLR和Tex_term）及其分化轨迹。网络分析确定了九个共功能模块（M1–M9）和四个共调控基因程序（G1–G4），其中M3和M8模块对抗调节基因程序，分别促进干性和耗竭程序或增殖和效应功能程序。

**IL-2信号与Tex状态中的ZMYND8**：在慢性感染中，P14细胞表现为Il2ra表达和CD25⁺细胞比例进行性下降。scCRISPR筛选显示Zmynd8是效应样细胞积累的顶级负调控因子和Tex_term细胞的正调控因子。ZMYND8缺陷增强了STAT5活性，并富集了Tex_int和Tex_KLR状态。

**ZMYND8阻碍效应样状态**：ZMYND8缺陷的P14细胞表现出Tex_int和Tex_KLR细胞的显著积累，伴随效应基因（Cx3cr1、Gzmb、Zeb2）和NK相关受体基因（Klrd1、Klre1、Klrg1、Klrk1）上调，而耗竭相关基因（Tox、Tox2、Cxcr6）下调。二次转移实验表明ZMYND8缺陷增强了Tex_prog向效应样状态的分化，并限制了向Tex_term的转化，同时促进Tex_int向Tex_KLR而非Tex_term分化。

**ZMYND8缺失增强抗病毒免疫**：ZMYND8缺陷的Tex亚群均表现出增强的体外杀伤能力，体内杀伤实验也证实其清除gp33肽脉冲靶细胞的能力提高。ZMYND8缺陷联合IL-2治疗进一步降低了病毒载量并改善了体内杀伤效果。

**ZMYND8拮抗IL-2信号**：ATAC–seq和单细胞多组学分析显示，ZMYND8缺陷增加了多个效应基因位点的染色质可及性，并富集了STAT5基序。ZMYND8缺陷增强了IL-2刺激后的STAT5磷酸化（p-STAT5）水平，降低了TOX表达，并上调了CD25和CD122表达。在人CD8⁺ T细胞中，ZMYND8缺陷同样增强了p-STAT5、CD25和CD122表达，并在慢性刺激条件下减少PD-1和TOX表达、增加IFNγ、TNF和GZMB产生。STAT5B、CD25或CD122的共缺失逆转了ZMYND8缺陷的表型，表明这些效应依赖于IL-2R–STAT5信号。

**ZMYND8限制p300激活IL-2R**：CUT&RUN分析显示ZMYND8与p300共占位于Il2ra和Il2rb的增强子区域，ZMYND8缺陷增加了p300的染色质占位和H3K27Ac沉积。荧光素酶报告实验证明ZMYND8直接抑制p300介导的IL2RA增强子活性，该抑制作用依赖其PHD、BRD、PWWP等组蛋白阅读器结构域。p300共缺失可逆转ZMYND8缺陷引起的CD25和CD122表达增加及效应样细胞积累，证实了ZMYND8–p300轴的调控关系。

**慢性刺激上调ZMYND8**：在慢性感染晚期和肿瘤浸润的Tex_term细胞中，Zmynd8表达和ZMYND8激活特征均升高。持续TCR刺激在体外可逐渐上调小鼠和人CD8⁺ T细胞中的ZMYND8表达，人HIV感染者和黑色素瘤患者数据也显示ZMYND8表达与耗竭相关基因正相关。

**ZMYND8缺失改善IL-2免疫治疗**：在B16-gp33肿瘤模型中，ZMYND8缺陷的P14细胞表现出增强的CD25、CD122和p-STAT5水平，以及增加的NKG2D和降低的TOX表达。ZMYND8缺陷联合IL-2治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存期，人CD19 CAR T细胞中ZMYND8缺陷也获得了类似结果。

**ZMYND8缺失增强ICB治疗**：ZMYND8活性与人类癌症患者ICB应答呈负相关。在B16-gp33肿瘤模型中，ZMYND8缺陷联合抗PD-L1治疗进一步改善肿瘤控制、小鼠生存和肿瘤内P14细胞积累，并增强体内杀伤能力。在LCMV Cl13慢性感染中，ZMYND8缺陷在抗PD-L1治疗条件下也显著抑制TOX表达并降低病毒载量。

**讨论与结论**

本研究发现ZMYND8是一个表观遗传变阻器，通过抑制p300介导的Il2ra转录激活来削弱IL-2R–STAT5信号，从而促进终末耗竭并限制效应样细胞分化。慢性抗原刺激（信号1）诱导ZMYND8表达，进而抑制IL-2信号（信号3），这一交叉调控机制揭示了T细胞耗竭中IL-2Rα表达逐渐丢失和STAT5信号受损的分子基础。ZMYND8缺陷可解除这一抑制，驱动Tex_KLR细胞积累并增强免疫治疗效果。鉴于全身性IL-2治疗的剂量限制性毒性，靶向ZMYND8有望为选择性增强治疗性CD8⁺ T细胞中的IL-2信号提供新策略，并与ICB疗法形成互补。该研究确立了表观遗传重连将免疫信号1和信号3连接起来以塑造Tex异质性和功能的新范式，为慢性感染和癌症的免疫治疗提供了潜在的新靶点。