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在Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号转导通路中，活化受体仅存在于初始的膜近端信号复合体（称为原myddosome，proto-myddosome）内数分钟。原myddosome迅速从TLR上释放，自组装（即成熟）为富含酶的胞质超
在Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号转导通路中，活化受体仅存在于初始的膜近端信号复合体（称为原myddosome，proto-myddosome）内数分钟。原myddosome迅速从TLR上释放，自组装（即成熟）为富含酶的胞质超分子组织中心，称为myddosome。myddosome诱导持续数小时的炎症基因表达。控制原myddosome释放的机制及其对信号转导的影响此前尚未明确。本研究鉴定了调控原myddosome成熟为无受体胞质myddosome过程的因子。通过巨噬细胞遗传筛选，研究人员鉴定出TRAM——此前被描述为调控MyD88非依赖性TLR信号——是myddosome组装的调控因子。利用生物化学、活细胞成像和重组蛋白活性重建，研究人员证明，质膜相关接头蛋白TIRAP引发原myddosome形成后，TRAM使MyD88从TLR–TIRAP复合物中解离，从而促成myddosome成熟和下游信号转导。在缺乏TRAM的情况下，MyD88无法从TLR–TIRAP复合物上解离，导致MyD88与下游信号酶发生异常且不稳定的相互作用。这些发现使研究人员能够将TRAM依赖性长效myddosome活性确定为TLR通路两个标志性特征的 determinants：持续数小时的NF-κB活化和次级反应基因表达。化学解离胞质myddosome可破坏TLR刺激细胞在体外和体内的既有炎症活性。总之，这项工作确立了TRAM作为myddosome成熟和信号转导调控因子的作用，为无受体信号转导提供了分子基础。
**论文解读：TRAM作为myddosome成熟调控因子的发现及其在无Toll样受体信号转导中的作用**
**1. 研究背景、现存问题与研究目的**
Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是一类跨膜模式识别受体，通过识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）启动固有免疫应答，被视为炎症和适应性免疫的守门人。经典受体信号转导观点认为，TLR活化后其胞质尾区直接作为支架组装信号复合物。然而，近期研究发现了一种非经典机制：活化TLR仅短暂地（数分钟内）参与初始的膜近端信号复合物——原myddosome（proto-myddosome），随后原myddosome从受体释放进入胞质，自组装（成熟）为富含酶的超分子组织中心——myddosome，进而驱动持续数小时的炎症基因表达。尽管这一受体游离状态的信号转导机制具有重要意义，但控制原myddosome从TLR释放的关键因子及其对信号转导的调控机制此前完全未知。本研究旨在通过系统性遗传筛选和深入的机制解析，鉴定调控myddosome成熟过程的分子开关，揭示无受体信号转导的分子基础。
**2. 研究人员开展的研究、主要结论与意义**
研究人员建立了基于流式细胞术侧向散射（side scatter，SSC）的分选策略，从全基因组CRISPR筛选中鉴定出TRAM（由Ticam2基因编码）作为myddosome组装的正调控因子。TRAM此前主要被认为在TLR4内体途径中介导TRIF依赖性信号，但本研究揭示了其全新功能：TRAM在质膜上促使MyD88从TLR–TIRAP复合物解离，从而释放原myddosome并使其成熟为胞质myddosome。在TRAM缺失时，MyD88与TLR–TIRAP复合物异常持续结合，形成的MyD88复合物不稳定，导致信号过早终止，NF-κB活化时间显著缩短，次级反应基因（secondary response genes，SRGs）表达受损。通过TIRAP:TRAM比例调控实验、体外重组蛋白活性重建和药理学myddosome解离实验，研究证实TRAM介导的myddosome成熟是TLR通路持久信号活性的决定因素。体内实验进一步表明，化学破坏myddosome可在小鼠中有效抑制炎症因子产生。该研究将TRAM确立为myddosome成熟的重要调控因子，为无受体信号转导提供了分子基础，拓展了受体信号转导机制的理论框架。该论文发表在《Nature》。
**3. 主要关键技术方法**
研究人员使用了以下关键技术手段：（1）全基因组CRISPR筛选：利用Julianna sgRNA文库转导MyD88–AGF iBMDMs（含NF-κB荧光报告基因和Cas9），通过SSC分选富集myddosome组装缺陷细胞；（2）流式细胞术分选结合RNA-seq分析：分离应答细胞（responders）和旁观细胞（bystanders）并比较转录组；（3）活细胞显微成像：包括共聚焦、全内反射荧光（total internal reflection fluorescence，TIRF）显微镜和荧光漂白后恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）；（4）生物化学分析：时间分辨免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）和免疫印迹；（5）重组蛋白体外表征：纯化TIR结构域蛋白并测定其形成浊度颗粒（turbidity-causing particles，TCPs）的能力；（6）体内药理学实验：对C57BL/6N小鼠腹腔注射TSI-13-57。样本来源包括iBMDMs（永生化骨髓来源巨噬细胞）、原代BMDMs（来自野生型WT和Ticam2
?/?小鼠，C57BL/6J背景）以及C57BL/6N小鼠。
**4. 研究结果**
**Myddosomes drive TLR gene programs（myddosome驱动TLR基因程序）**：通过流式分选和RNA-seq分析，研究人员发现LPS刺激后SSChigh细胞（应答细胞）含有myddosome，其转录组与整体LPS处理细胞相似，选择性诱导初级反应基因（primary response genes，PRGs）和次级反应基因（SRGs），而SSClow旁观细胞缺乏myddosome且不能有效诱导TLR反应基因。细胞因子染色证实仅应答细胞产生IL-6和TNF。此结果表明，含有myddosome的细胞是LPS诱导转录程序的主要来源。
**TRAM regulates myddosome assembly（TRAM调控myddosome组装）**：全基因组CRISPR筛选在LPS和LTA刺激条件下均鉴定出Ticam2（编码TRAM）为高排名候选基因。在TRAM缺陷（?Ticam2）细胞中，MyD88复合物滞留在质膜上，无法形成胞质myddosome，而TIRF显微镜定量显示原myddosome在?Ticam2细胞中持续存在且不再增大。这提示TRAM控制原myddosome的释放和myddosome组装。
**TRAM directs myddosome maturation（TRAM指导myddosome成熟）**：时间分辨免疫共沉淀显示，在WT细胞中原myddosome（MyD88–TIRAP–TLR4复合物）在数分钟内转变为myddosome（MyD88–IRAK–TRAF6复合物），而?Ticam2细胞中MyD88与受体/接头蛋白的异常相互作用持续数小时且复合物不稳定。TRAM以独特的时间动力学与MyD88结合，介导原myddosome从受体释放和随后的成熟过程。
**TRAM enables durable TLR signalling（TRAM支持持久TLR信号）**：免疫印迹和活细胞p65–mScarlet3成像显示，?Ticam2细胞能启动TLR诱导的信号通路，但NF-κB和TBK1活性提前终止，NF-κB核易位失去持续性，仅保留首个活性峰。RT–qPCR和ELISA证明?Ticam2细胞中Tnf和Il6表达显著降低，且此效应大部分不依赖TRIF。原代Ticam2
?/? BMDMs验证了这些发现。RNA-seq分析显示Ticam2
?/?细胞在6小时回到接近基线，SRGs未被激活。这说明myddosome稳定性对于持久信号和SRG表达至关重要。
**Pathway specificity of TRAM function（TRAM功能的通路特异性）**：利用多种PAMP刺激原代和永生化巨噬细胞，发现TRAM对质膜定位的TLR（TLR2/4）诱导的TNF、IL-6和IL-12p40分泌是必需的，而对TLR3、STING或RIG-I依赖的IFNβ/IP-10分泌无显著影响。IL-6和IL-12p40对TRAM缺失最为敏感。细菌感染实验表明，TRAM缺失巨噬细胞在感染大肠杆菌或金黄色葡萄球菌后IL-6产生减少，但TNF受影响较小。TRAM功能具有TLR通路和细胞因子特异性。
**Plasma membrane TRAM releases MyD88（质膜上的TRAM释放MyD88）**：?Ticam2 iBMDMs中回补TRAM野生型或突变体（G2A、3X、E180A、C114H、D88A/E89A）的实验显示，仅TRAM WT和E180A能支持原myddosome释放和TNF/IL-6分泌。用Fyn、Lyn或TIRAP质膜结合基序替换TRAM N末端构建嵌合体，发现仅含有TIRAP质膜结合基序的嵌合体（TIRAPPBM–TRAM）能恢复myddosome释放和IL-6分泌。3D显微镜定量显示，TRAM WT在富含磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）的质膜微域中富集，而TIRAPPBM–TRAM富集程度与TIRAP类似。这表明质膜PI(4,5)P2富集微域中的TRAM池负责促进myddosome成熟。
**TIRAP:TRAM ratio controls MyD88 activity（TIRAP:TRAM比例控制MyD88活性）**：利用CRISPRa系统激活内源性Tirap或Ticam2基因表达，结果显示TIRAP表达升高模拟了?Ticam2表型（MyD88滞留在质膜、IL-6分泌减少），而TRAM表达升高无此效应。更重要的是，同时上调TRAM可恢复IL-6分泌，且无论二者表达水平多高，只要比例恢复正常即可。质谱分析先确定了内源性TIRAP的N末端序列。此项表明，PI(4,5)P2富集微域中TIRAP:TRAM的比例是决定MyD88活性的关键因素。
**TRAM displaces TIRAP from MyD88（TRAM将TIRAP从MyD88置换出来）**：串联动力学免疫沉淀显示MyD88先与TIRAP结合（10分钟），随后同时结合TIRAP和TRAM（20分钟），最终仅与TRAM结合（40分钟），并在20分钟时检测到MyD88–TIRAP–TRAM三元复合物。用离子霉素耗竭PI(4,5)P2可将MyD88从质膜释放，但MyD88与TIRAP的相互作用仍保持且复合物不能成熟。体外重组蛋白实验证明，TIRAPTIR抑制MyD88TIR自组装（浊度降低>80%），而TRAMTIR单独无作用，但三者的TIR结构域混合时TRAMTIR逆转了TIRAPTIR的抑制作用。TIR结构域足以在体外重现这些功能，TRAM通过置换TIRAP解除对MyD88自组装的限制。
**Myddosome disruption terminates TLR signalling（myddosome解离终止TLR信号）**：使用MyD88TIR自组装抑制剂MPP处理已形成myddosome的细胞，发现MPP能以约30分钟的半衰期解离myddosome，且FRAP实验证明MPP abolished MyD88的动态交换。MPP处理导致NF-κB、MAPK和TBK1活性提前终止，Tnf和Il6转录及分泌减少。时间梯度实验显示MPP在刺激后2小时内添加可抑制TNF分泌，而在4小时后添加仍能抑制IL-6。长寿命的myddosome是TLR通路持续性信号所必需的。
**TSI-13-57 disrupts myddosomes in vivo（TSI-13-57在体内解离myddosome）**：小鼠腹腔注射LPS或LTA后，给予TSI-13-57（MPP衍生物）。免疫沉淀实验证实了PAMP诱导的myddosome在体内形成，TSI-13-57给药可破坏myddosome且不影响MyD88丰度。处理组小鼠血清中IL-6和IL-12p40在4.5小时显著降低，而LPS诱导的ISG表达不受影响，证明该效应是MyD88通路特异性的。体内实验结果证实长寿命myddosome对持续炎症因子产生具有重要意义。
**5. 讨论与结论**
基于上述发现，研究人员提出TLR通路是无受体信号转导的一个范例。与经典观点中受体作为信号复合物核心组分的模式不同，TLR通路中的myddosome在受体游离状态下才能有效发挥功能。该系统自组装阈值在受体释放后达到最大，实现了胞质信号放大，从而支持TLR通路特有的长时间信号和转录活性。这与IL-1R信号形成对比：IL-1R中受体锚定的myddosome产生与受体占据成比例的输出信号。研究结果为受体解离提供了不同于传统认知的功能视角——受体解离并非仅仅终止信号，而是启动信号的有效放大和持续。从机制上，TRAM促进原myddosome从受体复合物释放是一个关键发现，TRAM同时具有经TLR4介导TRIF信号的功能，这两种功能由不同的细胞器介导，这解释了TRAM同时存在于质膜和内体中的现象。研究结论是：TRAM是myddosome成熟和信号转导的重要调控因子，通过将原myddosome从TLR–TIRAP复合物中释放，使其成熟为胞质myddosome并维持持久信号活性，为无受体信号转导提供了分子基础。这些发现拓展了对信号转导机制的理解，并引发了关于是否存在其他类似信号策略的思考。
