胶质母细胞瘤中的生物钟：机制与治疗潜力

《Clocks & Sleep》：The Circadian Clock in Glioblastoma: Mechanisms and Therapeutic Potential

　　

胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人中一种侵袭性脑癌。昼夜节律调节睡眠-觉醒周期，进而影响人体的生理功能。昼夜节律紊乱与包括GBM在内的某些神经系统疾病相关。本篇叙述性综述重点阐述昼夜节律与GBM之间的关系、相关机制以及针对GBM的治疗策略。综述还讨论了核心时钟基因表达的改变如何促进胶质瘤发生，尤其是GBM，以及恢复正常时钟基因功能可能抑制GBM进展的机制。此外，时辰治疗（chronotherapy）可被视为GBM的一种潜在治疗策略。将化疗和放疗与每位患者的内在生物钟相对齐，可能有望提高治疗效果。更好地理解昼夜节律与GBM发病机制之间潜在的关联，可能有助于指导未来基于昼夜节律的治疗策略；然而，仍需进一步研究。

1. 引言
哺乳动物的昼夜节律是大脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）中一个约24小时的内在时钟，调控睡眠-觉醒周期。睡眠-觉醒周期影响多种生理功能，包括饮食习惯、体温和激素分泌。昼夜节律紊乱（circadian rhythm disturbances, CRDs）与代谢、精神及心血管疾病相关，并已被证实与癌症相关。核心时钟基因节律性表达的改变与胶质母细胞瘤（GBM）之间的关联已被提出。GBM是成人中最常见的恶性原发性中枢神经系统肿瘤，发病率约为每10万人3.19例。GBM的进展由多种遗传和分子异常驱动，导致信号通路显著改变。根据2021年世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类，GBM被定义为异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）野生型弥漫性星形细胞胶质瘤，WHO 4级，缺乏IDH1和IDH2基因突变。其组织学特征为微血管增生或坏死，分子学上定义为存在端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）启动子突变、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因扩增或联合的7号染色体获得/10号染色体丢失（+7/?10拷贝数变化）。神经干细胞（neural stem cells, NSCs）可能产生GBM；此外，GBM也可能起源于更分化的胶质细胞群体，如星形胶质细胞或少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells, OPCs）。恶性胶质瘤患者会出现头痛、癫痫发作、记忆丧失、局灶性神经功能缺损、意识模糊和人格改变等症状。GBM的症状比其他胶质瘤更严重。胶质母细胞瘤的标准治疗依赖于手术切除、放疗和化疗的不同组合；然而，生物技术方面的科技进步正在推动更新更精准疗法的开发。区分GBM患者的睡眠障碍（sleep disturbances, SDs）与肿瘤相关CRD很重要。SD可能是肿瘤或药物作用的结果；相比之下，肿瘤相关CRD可能与时钟基因表达改变以及GBM细胞内昼夜节律信号的中断有关，这些改变可影响增殖、干性、血管生成和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）修复。虽然这些过程可能相互影响，但不应将它们视为等同。GBM仍然是最致命的人类恶性肿瘤之一。其高度侵袭性行为以及对化疗和放疗的耐药性限制了当前治疗策略的有效性。GBM没有治愈性疗法，尽管有许多治疗进展，GBM患者的生存率仍然很低。与其他许多原发性脑肿瘤相比，GBM因其高度侵袭性和持续不良的预后而具有更迫切的治疗需求。基于昼夜节律的干预措施可能是一种有前景的补充策略，用于提高治疗疗效。本叙述性综述讨论昼夜节律与GBM之间的关系，并重点介绍其潜在机制和对GBM的治疗潜力。

2. 文献检索策略
本叙述性综述使用PubMed和Google Scholar，通过胶质母细胞瘤、脑癌、昼夜节律、时钟基因、时辰治疗、一天中的时间、放疗和替莫唑胺（temozolomide, TMZ）等关键词进行文献检索。检索未设置时间限制。随后，根据文献的相关性及其对本综述整体叙述的贡献进行筛选。

3. 生物钟的分子结构
昼夜节律的起搏器是下丘脑的SCN。昼夜节律系统由中枢时钟和外周时钟组成。SCN作为中枢昼夜节律起搏器，功能性分子时钟机制也广泛表达于大多数外周器官和组织中，产生局部昼夜节律并调节组织特异性生理过程。SCN中的中枢时钟可以独立运行，但组织中的外周时钟通过多种信号分子与中枢同步。哺乳动物昼夜节律的分子基础是转录-翻译反馈环（transcription–translation feedback loop, TTFL）。TTFL由两个激活因子——昼夜运动输出周期kaput蛋白（circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK）和脑和肌肉ARNT样蛋白1（basic helix-loop-helix ARNT-like 1, BMAL1）——以及两个抑制因子——隐花色素（cryptochromes, CRYs）和周期昼夜调节因子（period circadian regulators, PERs）组成。CLOCK和BMAL1蛋白在细胞质中异二聚化，随后转移至细胞核。CLOCK/BMAL1复合物与靶基因（包括CRY和PER）启动子中的增强子盒（enhancer box, E-box）元件相互作用。PER和CRY蛋白在细胞质中形成复合物，该复合物转移至细胞核并抑制CLOCK/BMAL1复合物的转录活性。此外，CLOCK/BMAL1复合物激活核受体亚家族1D成员（nuclear receptor subfamily 1 group D members, NR1D或REV-ERBα/β）和维甲酸相关孤儿受体（retinoic acid receptor-related orphan receptors, RORα/β/γ）的转录。另一方面，REV-ERBs通过阻断BMAL1启动子的ROR元件（ROR element, RORE）结合位点来抑制BMAL1的转录；相反，RORs促进BMAL1的转录。

4. 生物钟在细胞周期和DNA损伤中的作用
生物钟参与细胞周期、DNA修复和DNA损伤应答。生物钟通过控制检查点蛋白的转录影响DNA损伤检查点应答。此外，核心时钟系统调节参与产生、感知和转导检查点信号以及细胞周期停滞的基因。PER1与细胞周期控制有关。PER1过表达使人癌细胞对DNA损伤诱导的程序性细胞死亡（细胞凋亡）敏感化，而抑制PER1则减少同等处理细胞的凋亡。癌症患者样本中PER1水平普遍降低。PER2直接结合p53（一种关键的肿瘤抑制蛋白），并控制p53介导的转录活性。PER2与p53结合，并与鼠双微体2（murine double minute 2, Mdm2）形成稳定复合物，从而阻止Mdm2介导的p53降解并促进p53表达。Mdm2基因的转录由p53激活。MDM2蛋白刺激p53降解会抑制MDM2的产生。Per2表达受p53与其Per2启动子中响应元件结合的调节。Per2启动子中的p53响应元件与BMAL1/CLOCK结合的E-box元件重叠。p53通过阻断BMAL1/CLOCK与Per2启动子的结合来抑制Per2表达。Sun等人指出，人K562白血病细胞中PER2过表达导致G2/M期细胞周期停滞，并观察到细胞凋亡增加。同样，将Per2转染至白血病小鼠可抑制细胞增殖并加速K562细胞凋亡。Astone等人发现，损害Bmal1的内皮细胞特异性功能会导致新生小鼠血管组织和成体肿瘤血管生成环境中的血管生成缺陷。肝细胞癌细胞中Bmal1或Clock的下调可诱导细胞凋亡和G2/M期细胞周期停滞。Bmal1过表达抑制鼻咽癌细胞增殖，而其敲低则产生相反效果。Bmal1过表达还能抑制异种移植小鼠中的肿瘤生长，而Bmal1敲低则促进肿瘤生长。Bmal1过表达同时促进p53和p21表达，而敲低则抑制p53和p21表达。一项研究调查了人正常成纤维细胞（CCD-34Lu）中DNA损伤细胞应答与内源性PER2蛋白表达水平之间的关系。CCD-34Lu接受血清休克以诱导PER2蛋白的昼夜振荡，然后在PER2蛋白表达波谷和波峰相关时间用γ射线照射。结果显示，在PER2蛋白表达波谷照射的细胞中，克隆形成细胞存活、双链断裂（double-strand break, DSB）修复动力学和TP53蛋白水平均受到显著影响。总体而言，生物钟组分影响包括细胞周期进程、凋亡、DNA修复和血管生成在内的不同生物学过程。单个时钟基因作用的差异表明这些基因具有互补功能，并凸显了它们在不同组织中调节的复杂性。

5. 癌症中的昼夜节律失调
在哺乳动物中，生物钟调节众多生物学过程。有证据表明生物钟基因作为肿瘤抑制因子，在延缓癌症发展中发挥作用。生物钟被认为影响癌症发展的相关通路，包括细胞周期控制、凋亡和DNA损伤应答。CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、CRY1和CRY2基因中的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）被认为与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌易感性增加相关。

6. 脑癌中的昼夜节律紊乱
临床和实验证据表明脑癌中存在CRD。一项横断面研究探讨了原发性脑肿瘤患者人群中SD的患病率。该研究纳入424名平均年龄49岁的患者，其中58%为高级别胶质瘤（high-grade gliomas, HGGs）。19%的患者报告存在中度至重度SD，这与年龄较小、卡氏功能状态较差以及磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）上的肿瘤进展相关。Miaskowski等人评估了包括脑癌在内的多种癌症患者在放疗开始时睡眠参数与疲劳之间的关联。使用体动记录仪、匹兹堡睡眠质量指数、总体睡眠障碍量表和李氏疲劳量表测量夜间睡眠/休息、白天觉醒/活动和昼夜活动节律参数。30%至50%的患者在放疗开始时经历睡眠-觉醒昼夜活动节律障碍。已有研究表明，CRD和SD在脑肿瘤患者中常见，并可能影响其神经功能和生活质量。

7. 胶质母细胞瘤中的时钟基因
证据显示慢性CRD与胶质瘤风险之间存在关联。Trebucq等人在人GBM裸鼠模型中研究了Bmal1的作用。肿瘤由Bmal1敲低的LN229细胞原位异种移植至背侧纹状体产生。肿瘤中Bmal1破坏导致生存期缩短、肿瘤生长和CD44表达增加、运动功能恶化以及肿瘤微环境中星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达增加。Dong等人报道，胶质瘤干细胞（glioma stem cells, GSCs）中BMAL1或CLOCK的下调可诱导细胞周期停滞和凋亡。在将GSCs植入免疫缺陷小鼠额叶前下调Bmal1或Clock，可使荷瘤小鼠寿命延长约两倍。此外，核受体REV-ERBα/β的小分子激动剂SR9011和SR9009以及CRY稳定剂KL001可下调干细胞因子并减少GSC生长。SR9011与KL001联合使用进一步产生协同抗肿瘤效果。KL001还降低了GSCs中PER1和PER2的表达并升高BMAL1蛋白水平。此外，使用GBM小鼠模型评估了潜在CRY稳定剂SHP656的疗效。SHP656耐受性良好，小鼠无体重减轻或行为改变。Ma等人提出，PER2 mRNA和PER2蛋白水平在GSCs中下调。在体外和体内过表达PER2后，他们报道GSC阻滞于G0/G1期，通过Wnt/β-catenin信号通路抑制细胞增殖、干性潜能和侵袭能力。因此，他们提出PER2在胶质瘤恶性进程中发挥作用，并可能作为治疗靶点。一项先前研究显示CLOCK-BMAL1复合物可能调节GBM小鼠模型和GBM患者肿瘤样本中GSCs与内皮细胞之间的相互作用。该研究提出骨膜蛋白（periostin, POSTN）是一种促血管生成因子，通过激活TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1, TBK1）促进内皮细胞中的肿瘤血管生成。CLOCK-olfactomedin样3（OLFML3）-缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1α）轴被证明调节该过程。另一项研究表明，时钟基因在胶质瘤中失调，并与胶质瘤预后和肿瘤进展相关。沉默永恒昼夜调节因子（TIMELESS）会破坏时钟基因表达并诱导G0/G1期细胞周期停滞。这些发现表明昼夜节律信号的中断可能促进胶质瘤进展。为了评估维甲酸相关孤儿受体A（RORA）的抗胶质瘤作用，Jiang等人采用了细胞活力测定、EdU测定、神经球形成测定和异种移植实验等方法。结果表明RORA在胶质瘤中低表达。RORA过表达抑制胶质瘤细胞系和GSCs的增殖和肿瘤发生。该过程似乎通过抑制肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα）介导的核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）信号通路来实现。使用Kaplan–Meier生存分析测量胶质瘤患者临床样本的中位生存时间。高RORA表达患者的生存时间长于低RORA表达患者。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid, RNA）-18a（miR-18a）通过降解RORA基因促进胶质瘤生长。作者提出miR-18a过表达可能是胶质瘤中RORA低表达的原因。生物钟在GBM生物学中发挥互补而非相同的功能。另一方面，操纵时钟基因所用方法的差异可能解释了所报道信号通路的可变性。

8. 胶质母细胞瘤中的时辰治疗
时辰治疗是指根据机体昼夜节律确定最佳给药时间。时辰治疗有两种实施方式：一是改变患者的睡眠-觉醒周期以改善病理状态；二是考虑患者的昼夜节律以增强治疗效果。Slat等人研究了TMZ给药时间对人及小鼠GBM细胞疗效的影响。他们发现昼夜节律治疗时间影响体外小鼠GBM肿瘤细胞对TMZ的敏感性。此外，在Bmal1表达的每日峰值附近，TMZ诱导的DNA损伤应答、凋亡激活和生长抑制最为显著。作者指出，将TMZ给药时间调整至肿瘤细胞Bmal1表达峰值可提高TMZ疗效。此外，Bmal1缺失导致TMZ诱导的基因表达昼夜节律、凋亡激活和生长抑制消失。另一项研究假设TMZ的疗效可能取决于给药时间、DNA修复酶以及O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）——一种关键DNA修复蛋白——在鼠和人GBM模型中的活性。体外记录显示GBM细胞中Bmal1、Per2和Mgmt表达存在内在昼夜节律。这些GBM细胞在Bmal1转录每日峰值时对TMZ更敏感。Gonzalez-Aponte等人评估了体外GBM中MGMT启动子甲基化的每日节律以及不同时间点收集的人GBM活检组织中MGMT甲基化情况。此外，还测量了每隔四小时收集的GBM细胞中MGMT和BMAL1蛋白水平。在体外TMZ最大疗效时间点，MGMT蛋白水平最高。Nelson等人使用GBM细胞系以及对BMAL1、NR1D1（REV-ERBα）和PER2的药理学操作，指出TMZ敏感性取决于一天中的时间。时钟基因破坏降低了TMZ疗效。该研究提到昼夜节律表型与GBM中TMZ药效学之间存在密切关系。综合来看，这些临床前研究表明TMZ的疗效不仅取决于给药，还受GBM细胞分子昼夜节律状态的影响。核心时钟组分的振荡似乎调节DNA损伤应答、凋亡和MGMT介导的修复通路。这些发现可能提示TMZ给药中的时辰治疗是化疗疗效的一个生物学决定因素。此外，与傍晚给药相比，早晨体内给予TMZ可减小肿瘤体积并增加体重。Damato等人在回顾性研究中审查了新诊断GBM患者的手术和放化疗记录，这些患者在早晨或傍晚接受TMZ。早晨和傍晚组研究特征之一是基线类固醇使用情况，两组无显著差异。早晨接受TMZ的患者总生存期长于傍晚接受者。一项近期研究使用基于可穿戴设备的体动记录数据来自胶质瘤患者，并结合人昼夜节律数学模型，根据外部时钟时间和患者内部昼夜节律时间量化TMZ给药的最佳时间。结果表明，患者内部和患者之间的每日节律差异导致给药时间在内部昼夜节律时间上的差异大于外部时钟时间。在一项回顾性研究中，选取121名接受标准放疗并分别在早晨或下午接受TMZ化疗的高级别胶质瘤患者。下午放疗组的总生存期和无进展生存期优于早晨组。此外，放疗后下午放疗组的淋巴细胞表达水平高于早晨放疗组。在Neves等人的研究中，每4小时分析U87胶质瘤细胞中PER2和BMAL1表达，持续24小时。细胞同步后立即的时间点被视为第一时间点（T0）。使用两种不同的计算模型，观察到BMAL1和PER2分别在T16和T8时间点具有最高昼夜节律活性。进一步分析显示T7和T8是转铁蛋白受体表达的关键时间点。有趣的是，通过U87胶质瘤细胞的共聚焦显微镜研究，在T8时间点检测到复合物的最高细胞内摄取和p53蛋白表达。此外，p53 mRNA水平评估证实了蛋白水平的转录变化，表明T16似乎是提高U87 GBM细胞治疗疗效的最佳时间点。结论认为，将治疗与GBM细胞的生物钟对齐可能改善GBM治疗策略。一项研究报告，表达低水平PER1的U343胶质瘤细胞系在暴露于12.4 Gy/min X射线照射时表现出轻微DNA损伤。此外，PER1下调与X射线照射后U343细胞群凋亡减少相关。辐射导致高表达PER1的细胞死亡率高于其他细胞。Yassine等人研究了放疗给药时间对肝癌小鼠海马神经源性微环境中促炎细胞因子、时钟基因、胶质激活标志物、氧化应激、神经元活性和增殖的影响。结果表明，在小鼠光照/非活动期进行放疗会影响海马中的上述因素。作者得出结论，在小鼠活动期进行放疗可能对肿瘤组织具有最高疗效，并对肝组织和海马的副作用最小。相比之下，一些研究显示不同给药时间下TMZ治疗效果没有差异。在一项前瞻性随机试验中，胶质瘤患者被随机分配在上午10点前或晚上8点后接受TMZ。两组患者在不良事件、生活质量或总生存期方面未观察到显著差异。Geurts等人评估了在早晨、下午或傍晚接受TMZ的GBM患者的毒性和生存数据。患者结局未观察到差异。Sapienza等人也评估了放疗时间是否影响HGG患者的结局或毒性事件。然而，他们未发现早晨或下午治疗患者的总生存期或无进展生存期存在差异。这些发现表明，GBM时辰治疗获益可能不仅仅是选择合适的给药时间。现有研究表明，对TMZ的反应可能受GBM细胞昼夜节律状态的影响，而不仅仅是给药时间。不一致的结果可能反映了时辰治疗在GBM中作用的复杂性。各种参数，包括患者时间型差异、肿瘤特征和治疗方案，可能导致所报道结局的差异。这些观察结果表明，单独的外部时钟时间可能不足以优化治疗时间安排。此外，这些观察凸显了考虑GBM细胞特征和每位患者内在昼夜节律的重要性，以实现个体化治疗并可能提高化疗和放疗疗效。有趣的是，昼夜节律与血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）完整性之间的关联已被提出。考虑BBB节律与给药时间一致的时辰治疗策略可以改善药物进入大脑的渗透性，并提高包括GBM在内各种疾病的治疗效果。此外，昼夜节律影响化疗和放疗的药代动力学和药效学。药物转运蛋白跨生物膜的分布受昼夜节律影响。给药时间可能影响药物的吸收、分布、代谢和排泄（absorption, distribution, metabolism, and excretion, ADME）。尽管有生物学依据，GBM时辰治疗的临床结果（如多项研究所指出的）似乎是不一致的。总体而言，证据表明时辰治疗不应仅仅被视为早晨或傍晚给药。其有效性可能取决于将治疗与患者和肿瘤的内在昼夜节律对齐。另一方面，时钟时间不应等同于生物学时间。由于时间型、睡眠-觉醒时间表和光照暴露的差异，个体的内源性昼夜节律阶段存在差异。未来研究应超越简单的早晨与傍晚比较。纳入体动记录、睡眠相关指标和分子分层（包括MGMT相关特征）的前瞻性设计可能有助于识别在治疗反应上存在时间依赖性差异的亚组。

9. 讨论
需要注意的是，部分引用的临床研究评估的是患者的睡眠质量和疲劳，而非直接评估昼夜节律或分子时钟功能。尽管如此，这些研究仍具有相关性，因为GBM患者的SD和疲劳是CRD的常见表现。在GBM患者中，神经功能障碍、药物以及放化疗可能导致睡眠-觉醒周期紊乱。因此，尽管这些临床研究未直接研究昼夜节律机制，但它们提供了GBM和其他恶性肿瘤中CRD的间接证据。关于BMAL1在GBM中的作用，文献中存在矛盾。多项研究支持BMAL1的肿瘤抑制功能。有研究提出BMAL1表达破坏可能增加肿瘤生长，其缺失消除了TMZ诱导凋亡和生长抑制的昼夜节律。相反，BMAL1被证明对GSCs的维持是必需的，沉默BMAL1或CLOCK可诱导细胞周期停滞和凋亡。这种明显的不一致可能源于BMAL1在GBM中上下文依赖的功能。BMAL1可能在分化的肿瘤细胞中发挥肿瘤抑制作用，同时支持GSCs的存活。与BMAL1相比，关于PER2的证据普遍一致支持其在GBM中的肿瘤抑制功能。PER2过表达抑制GSCs的增殖、干性和侵袭，并促进细胞周期停滞。然而，目前大多数证据来自体外实验和临床前研究。不同研究的矛盾结果可能归因于研究设计和方法学的差异。实验模型、患者群体、昼夜节律评估方法和治疗方案等因素的差异可能影响治疗结局。此外，核心时钟基因表达的差异、其不同功能以及GBM的分子特征可能导致不一致的结果。在比较证据时应考虑这些因素，这可以解释所报道的时辰治疗在GBM中获益的矛盾。此外，与肿瘤和患者相关的多种因素，如MGMT启动子甲基化状态、时间型、类固醇使用和治疗方案，可能影响治疗结局。未来的时辰治疗策略可能受益于使用可穿戴设备进行个性化昼夜节律评估。由于昼夜节律阶段因人而异，体动记录等非侵入性方法可能有助于评估睡眠-觉醒周期和昼夜节律组分，以优化每位患者的治疗时机。这种个体化策略可能与经历CRD的GBM患者相关。然而，需要前瞻性临床研究来确定个体化时辰治疗是否能比常规治疗方案提高疗效。需要注意的是，虽然临床证据正在扩大，但当前相当一部分发现仍来自临床前研究。此外，许多研究基于时钟时间而非生物学时间报告治疗时机，这可能导致不一致的结果。因此，在当前证据得到更多临床研究验证之前，应谨慎解读。

10. 结论
昼夜节律在维持生理过程和分子机制（包括细胞周期和DNA修复）中的作用已在文献中得到充分记载。CRD与包括GBM在内的恶性肿瘤之间的关联也已被报道。核心时钟基因表达的改变可能促进胶质瘤发生。此外，临床前研究显示，恢复正常时钟基因功能可部分抑制GBM进展。此外，时辰治疗已被提出作为GBM治疗中一种有前景的未来策略。虽然并非所有研究都重现了获益，但将化疗和放疗与每位患者的内在生物钟对齐可能代表一种优化治疗效果的潜在方法。理解昼夜节律与GBM发病机制关联的潜在机制，有助于促进基于昼夜节律的治疗策略的开发。

11. 未来方向
关于CRD与GBM关系的证据日益增多。需要进一步的实验性和前瞻性临床研究来理解昼夜节律改变如何导致肿瘤发生和治疗耐药的机制。使用客观昼夜节律测量而非仅依赖时钟时间来评估GBM患者的CRD，可能是个体化治疗策略的一种有价值方法。此外，可以使用体动记录等个体参数评估每位患者的昼夜节律阶段。进一步而言，基于每位患者个体昼夜节律阶段进行化疗和放疗等治疗给药可能是有益的。