人工葡萄糖代谢酶用于适应性肿瘤代谢免疫治疗

《Cell Biomaterials》：An artificial glucose metabzyme for adaptive tumor metabolic immunotherapy

　　

摘要 异常葡萄糖代谢是肿瘤代谢重编程的标志性特征，它破坏了细胞代谢与抗肿瘤免疫监视之间的偶联。虽然天然葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOx）能有效调控葡萄糖氧化，但其治疗功效在酸性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中因结构不稳定性而受到根本性限制。在此，研究人员介绍了一种人工葡萄糖代谢酶（artificial glucose metabzyme, AGM），其采用计算引导的仿生进化化学设计（bioinspired evolutionary chemical design, BioEvoCD）策略设计而成。该策略整合了天然酶的结构精确性与无机材料的稳健性，生成了架构可编程的代谢酶，模拟GOx以黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）为中心的锥形催化架构，同时克服了其环境脆弱性。通过将葡萄糖氧化与过氧化物酶样活性相偶联，AGM建立了自我放大的代谢-氧化还原级联反应，在酸性TME条件下催化性能显著增强。该级联反应有效抑制乳酸积累，恢复有利于环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS）激活的代谢环境，并最终驱动强大的cGAS-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）介导的抗肿瘤免疫应答。在黑色素瘤荷瘤小鼠中全身给药AGM可重建代谢-免疫偶联，诱导树突状细胞（dendritic cell, DC）扩增和T细胞启动，导致显著的肿瘤消退。值得注意的是，尽管存在代谢重建的高乳酸微环境，AGM对原发肿瘤和远隔肿瘤均维持强大的疗效，大幅优于包括环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate, cGAMP）和干扰素β（interferon β, IFN-β）在内的常规免疫疗法。这项工作确立了AGM作为一类新的架构可编程代谢酶，为肿瘤免疫治疗中克服代谢屏障和恢复免疫功能提供了一种适应性策略。

一、研究背景与科学问题

肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的异常葡萄糖代谢是肿瘤进展和免疫逃逸的关键驱动因素。肿瘤细胞通过增强糖酵解通量和乳酸积累，破坏细胞代谢与抗肿瘤免疫监视之间的偶联，使环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）等先天免疫通路在基因完整的情况下被功能性沉默。天然葡萄糖氧化酶（GOx）虽能特异性氧化葡萄糖并产生过氧化氢（H₂O₂），从而实现对肿瘤的"饥饿"治疗并重振免疫应答，但其在酸性TME中面临严重的结构脆弱性——酸性条件诱导活性位点残基质子化，破坏催化循环，严重限制其治疗功效。此外，现有的GOx模拟纳米酶（如金纳米颗粒）普遍存在底物选择性差、依赖碱性介质、缺乏精确识别基序和质子接受位点等问题，无法在酸性TME中有效发挥催化功能。因此，如何在稳健的无机框架中重建天然酶的催化逻辑，同时克服其在肿瘤微环境中的脆弱性，成为代谢免疫治疗领域的核心挑战。

二、研究内容与核心发现

针对上述挑战，研究人员提出了一种计算引导的仿生进化化学设计（BioEvoCD）策略，通过原子级精确的构象设计，在稳健的无机框架内重建并进化类酶催化架构。作为概念验证，研究人员设计了首个人工葡萄糖代谢酶（AGM），将金属-氧催化基序与锥形空腔——从GOx以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为中心的锥形构象特征中抽象而来——整合到富氧空位的氧化钼晶格中，实现仿生空间限域和酸性条件下适应性协同质子-电子转移（concerted proton-electron transfer, CPET）。AGM同时具备GOx样和过氧化物酶（POD）样活性，在酸性TME中形成自我放大的葡萄糖-氧化还原级联反应，通过抑制乳酸积累、重编程氧化还原和离子信号，恢复有利于cGAS激活的代谢环境，驱动强大的cGAS-STING介导的抗肿瘤免疫应答。在代谢重建的高乳酸应激异步双侧黑色素瘤模型中，AGM对原发和远隔肿瘤均表现出显著优越的治疗效果，远隔肿瘤抑制率达76.96%，大幅超越常规免疫激动剂cGAMP（7.22%）和IFN-β（1.09%），并驱动IFN-β水平较cGAMP组提高2.37倍、树突状细胞（DC）活化较IFN-β组增强3.52倍。

三、关键技术与方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：第一，量子化学筛选技术，通过原子空间构型、费米能级占据和pH依赖性能垒三个正交拓扑描述符，系统筛选最优掺杂元素和掺杂比例；第二，密度泛函理论（DFT）计算，用于揭示Co掺杂水平如何调控MoO_3?x框架的结构-活性关系和结构演化机制；第三，刻蚀-吸附-固定化合成策略，通过十六胺诱导的还原性刻蚀产生缺陷位点，实现金属物种的单原子固定化；第四，多种先进表征手段，包括球差校正高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）、扩展X射线吸收精细结构谱（EXAFS）、电子顺磁共振（EPR）、X射线光电子能谱（XPS）等，用于验证原子级结构和配位环境。研究采用B16黑色素瘤荷瘤小鼠模型和异步双侧肿瘤模型进行体内疗效评估。

四、研究结果

（一）BioEvoCD策略指导的AGM理性自下而上设计

研究人员通过系统分析确定氧化钼（MoO_3?x）为最优基质，因其具有内在不稳定的配位环境和丰富的电子可调性。量子化学筛选表明，Co掺杂结构在费米能级处表现出显著增强的态密度（DOS），有利于高效电荷传输和降低葡萄糖脱氢动力学势垒。DFT计算揭示了多阶段固态重组机制：Co原子逐步掺入Mo空位，经历中间态（Co_TBP/OCT-Mo_SPO_3?x）后发生对称性破缺重构，最终形成稳定的锥形配位构型（Co_OCT/TBP-Mo_SP/TETO_3?x）。Mo:Co比例在1:1以上且≦3:1被确定为动力学稳定含氧空位中间体的有利组成窗口。

（二）结构验证与拓扑模拟催化保真度

研究人员通过刻蚀-吸附-固定化策略合成了系列金属掺杂MoO_3?x纳米颗粒。在0.5:1前驱体比例下合成的Co掺杂NPs-3（即AGM）表现出最高的葡萄糖消耗活性和唯一的葡萄糖酸持续生成能力。EPR分析验证了Mo空位和氧空位的同步生成，XRD证实低Co掺杂对MoO₃原子构型影响可忽略，而高掺杂驱动向有序CoMoO₄相转变。XPS显示AGM具有最高比例的Co²⁺、Mo⁵⁺和氧空位。底物选择性评估表明，AGM对葡萄糖表现出与天然GOx相当的高保真识别能力，而Au NPs对糖类结构类似物缺乏区分能力。HAADF-STEM和EXAFS分析确认了Co物种的原子级分散和六配位八面体配位环境（Co-O配位数6.1）。

（三）AGM的催化性能与机制解析

体外催化研究表明，AGM的GOx样活性呈浓度和时间依赖性，米氏常数（K_m）为1.82 mM，最大反应速率（V_max）为4.89 mM/min，转换频率（K_cat）达66.08 s^?1，约为天然GOx（9.71 s^?1）的6.8倍。AGM在至少四个连续反应循环中保持催化性能。通过ABTS^+?电子受体实验和ROS清除剂实验证实，葡萄糖氧化通过直接脱氢途径进行而非ROS介导机制，Co³⁺作为电子受体参与葡萄糖脱氢。值得注意的是，AGM的GOx样活性随pH从7.4降至5.0而逐渐增强，而天然GOx在酸性条件下活性显著受损。DFT计算揭示酸性条件下CPET途径显著降低葡萄糖吸附和脱氢步骤的能垒。AGM同时表现出pH依赖的POD样活性，在酸性条件下催化效率显著增强，以¹O₂为主要活性氧物种。在无外源H₂O₂条件下，AGM有效介导GOx-POD级联催化，且级联能力随pH降低而增强。

（四）体外代谢调控与肿瘤-免疫偶联

体外实验表明，AGM处理显著降低B16肿瘤细胞内外葡萄糖和乳酸水平，且在酸性条件下效果更为显著。代谢组学分析显示AGM显著增强葡萄糖消耗，下调糖酵解和三羧酸循环关键中间体，破坏糖酵解碳通量。AGM显著抑制葡萄糖正调控的NSUN2和TREX2表达，上调cGAS蛋白水平，并通过co-IP实验证实其有效抑制乳酸诱导的cGAS乳酰化修饰，同时不影响AARS2表达。AGM处理显著增加细胞内cGAMP水平，升高p-STING、p-TBK1和p-IRF3水平（分别较PBS对照组提高4.82、8.32和6.11倍），促进IFN-β分泌，且能有效抵抗外源乳酸补充介导的免疫抑制。AGM还显著升高细胞内ROS水平、降低线粒体膜电位、诱导γ-H2AX聚焦形成（DNA双链损伤标志），并在酸性环境中对B16肿瘤细胞表现出增强的细胞毒性，而对HEK293T正常细胞和CD8⁺ T细胞毒性可忽略。在肿瘤细胞-树突状细胞互作层面，AGM处理的肿瘤细胞上清液即使在乳酸补充条件下也能显著促进DC成熟（CD80⁺CD86⁺），较IFN-β+乳酸组提高1.74倍，并显著升高IL-12p70和TNF-α分泌。AGM还显著增强CRT表面暴露和HMGB1释放，诱导免疫原性细胞死亡。

（五）体内代谢-免疫重编程与抗肿瘤疗效

体内研究表明，AGM经静脉注射后在肿瘤部位快速蓄积（4 h达峰）并持续滞留至72 h。AGM处理显著抑制B16肿瘤生长，有效消耗瘤内葡萄糖和乳酸，下调TREX2表达，上调cGAS水平，激活cGAS-STING通路（p-STING、p-TBK1、p-IRF3升高），增加瘤内cGAMP和IFN-β水平。流式细胞术显示AGM处理显著增加肿瘤内成熟DC、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞浸润，升高IL-12p70、TNF-α、颗粒酶B和IFN-γ水平。组织学染色证实AGM有效抑制肿瘤增殖、诱导免疫原性细胞死亡并促进CD8⁺/CD4⁺ T细胞浸润。安全性评估显示AGM不引起体重变化、血液生化指标异常或器官组织学损伤，且不显著改变血清和主要器官的葡萄糖水平，表明其肿瘤选择性催化活性最小化系统代谢扰动。

（六）双侧肿瘤模型中的适应性全身代谢-免疫再唤醒

在时间错开的双侧B16黑色素瘤模型中，AGM对原发和远隔肿瘤均表现出显著优越的治疗效果，远隔肿瘤抑制率达83.79%，显著超越cGAMP（46.37%）和IFN-β（27.09%）。在原位注射外源乳酸重建的高乳酸微环境中，AGM仍维持对原发（70.39%）和远隔（76.96%）肿瘤的强效抑制，而cGAMP（32.24%；7.22%）和IFN-β（24.44%；1.09%）的疗效被严重削弱。AGM选择性消耗瘤内葡萄糖并抑制乳酸积累，下调NSUN2和TREX2，上调cGAS和STING，驱动IFN-β产生（较cGAMP组高2.37倍）。即使在乳酸应激条件下，AGM仍维持强大的DC活化（肿瘤和肿瘤引流淋巴结中成熟DC比例分别较乳酸单独组提高5.31和4.73倍），促进CD8⁺ T细胞在原发肿瘤、肿瘤引流淋巴结和远隔肿瘤中的系统性扩增，并显著减少乳酸富集荷瘤小鼠的肺转移结节数量。

五、讨论与结论

本研究通过计算引导的BioEvoCD策略创建了架构可编程代谢酶，超越了结构模拟而实现功能进化。通过抽象GOx的锥形FAD中心架构并将其嵌入电子可编程的无机晶格中，研究人员设计了能够在酸性肿瘤条件下持续高效进行葡萄糖氧化的AGM。该代谢酶整合POD样活性形成自我放大的葡萄糖-氧化还原级联，消耗葡萄糖、抑制乳酸、重编程氧化还原和离子信号，恢复有利于cGAS激活的代谢环境。在黑色素瘤模型中，AGM通过逆转乳酸诱导的免疫抑制并激活DC和T细胞实现全身免疫激活，即使在乳酸富集TME中也达到76.96%的远隔肿瘤抑制率，显著超越cGAMP（7.22%）和IFN-β（1.09%）。研究结论表明，模拟天然代谢酶底物识别和催化微环境、并通过原子级精确构象设计进一步优化内在催化转换和环境适应性的架构可编程代谢酶，可作为代谢信号和免疫应答的主动调节器，用于适应性肿瘤代谢免疫治疗。BioEvoCD策略为解码和优化天然酶的几何和电子原理、重建多样化催化架构提供了通用途径，可扩展至其他辅因子依赖性氧化还原酶和具有不同活性位点构型的金属酶，为靶向癌症及其他代谢疾病的更广泛代谢脆弱性开辟了可编程人工代谢酶的机遇。