《Cell Biomaterials》：Autolysosomal degradation-inhibitory nanoparticles for enhanced mRNA escape and cytokine therapy
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脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）是mRNA疗法的关键递送载体，除了内涵体滞留外，还面临一个未得到充分认识的自噬溶酶体降解屏障。研究人员通过合成脂质偶联的氯喹类脂质（lipid-conjugated chloroquine lip
脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）是mRNA疗法的关键递送载体，除了内涵体滞留外，还面临一个未得到充分认识的自噬溶酶体降解屏障。研究人员通过合成脂质偶联的氯喹类脂质（lipid-conjugated chloroquine lipidoids），并将其替代可电离脂质引入纳米颗粒中，制备出自噬溶酶体降解抑制性（autolysosomal degradation-inhibitory，AUDI）LNPs。当偶联脂质的烷基链含有12个碳原子且替代率为30%时，AUDI-LNPs达到最佳性能。此外，AUDI技术使LNPs的体外和体内递送效率提高了约5倍，并与多种LNP配方、细胞系及mRNA类型兼容。总体而言，将自噬抑制剂掺入LNPs旨在防止mRNA过早降解，AUDI-LNPs提供了一种通用且即插即用的策略来绕过自噬溶酶体降解屏障，从而增强mRNA逃逸与治疗效能，为未来基因治疗和疫苗开发提供新见解，同时维持安全窗口。
脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）是目前唯一经临床批准的可重复实现全身性mRNA给药的非病毒递送平台，其临床价值已通过COVID-19疫苗的快速开发与全球部署得到验证。然而，LNPs介导的mRNA递送仍面临显著的胞内效率瓶颈：经内吞入胞后，仅1%～4%的mRNA能够成功逃逸内涵体到达胞质，大部分mRNA被运输至溶酶体降解。传统研究长期聚焦于内涵体逃逸这一障碍，却忽视了逃逸后另一个被低估的屏障——自噬溶酶体降解途径。LNPs逃逸内涵体时造成的膜损伤会触发自噬，自噬体与内涵体/溶酶体融合后形成自噬溶酶体，将内部mRNA降解。针对该屏障，已有研究尝试游离给药自噬抑制剂如氯喹（chloroquine，CQ）或巴弗洛霉素A1，但存在载体与抑制剂缺乏亚细胞水平共定位、全身性自噬调节的潜在毒性以及药代动力学欠佳等局限。因此，亟需一种能够与mRNA货物同步定位、特异性地在细胞内抵消自噬溶酶体降解的递送策略。研究人员据此提出“规避自噬溶酶体降解屏障”（circumvent autolysosomal degradation barrier，CADB）策略，合成脂质化CQ类脂质（AUDI-lipidoid），将其作为通用第五组分共价嵌入LNP结构，形成AUDI-LNPs，以期将自噬溶酶体降解从不可避免的障碍转化为可调的设计参数。
围绕这一目标，研究人员开展了一系列机制验证与转化研究，并得出关键结论：在CQ与不同长度烷基环氧化物（C6～C18）开环反应合成的系列AUDI-lipidoid（CQn）中，含12个碳烷基尾的CQ12与30%摩尔替代率组合实现最佳转染性能；脂质化修饰在降低CQ固有细胞毒性的同时保留了其自噬抑制功能；AUDI-LNPs的体外和体内mRNA递送效率较常规LNPs提高约5倍，且与三种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的LNPs配方兼容；在银屑病和急性肺损伤小鼠模型中展现出显著治疗疗效，并维持与母体LNPs相当的安全窗口。
为阐述该策略，研究人员采用了多项关键技术方法。CQ12通过CQ与1,2-环氧十二烷的开环反应合成并经高效液相色谱、高分辨质谱和核磁共振氢谱表征；LNPs采用乙醇注入法制备，以30%CQ12替代SM-102等可电离脂质；纳米颗粒的粒径、zeta电位、mRNA包封效率和表观pKa分别通过动态光散射、透射电子显微镜、RiboGreen荧光法和TNS法测定；自噬抑制功能借助GFP-RFP-LC3双荧光自噬指示系统、Western blot检测LC3-II/LC3-I比率与p62积累、透射电镜观察自噬体/两性体形成以及质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）分析细胞摄取。在样本队列方面，体外实验使用HEK293T、DC2.4、B16、小鼠表皮角质形成细胞（MEK）和小鼠肺成纤维细胞（MLF）；体内研究采用BALB/c小鼠（皮下和静脉途径）及C57BL/6小鼠（气管内途径和疾病模型），动物实验经北京理工大学伦理委员会批准。
研究结果分述如下。
**合成与筛选AUDI-lipidoid**：通过CQ与1,2-环氧烷烃的开环反应合成C6～C18烷基尾的CQn系列，质谱确证结构。以萤火虫荧光素酶（Luc）mRNA为报告基因，在HEK293T细胞中系统性替换SM-102可电离脂质，筛选出12碳烷基尾的CQ12性能最优；进一步优化替代比例，确定30%摩尔替代率达到峰值转染效率，过高替代率可能破坏LNP结构稳定性而导致性能下降。
**CQ12与AUDI-LNPs表征**：脂质化显著降低CQ的细胞毒性（CCK8法），且Western blot显示CQ12保持与CQ相当的自噬抑制能力（LC3-II/LC3-I比率和p62积累）。AUDI-LNPs呈均匀球形，水合粒径约123 nm，PDI为0.105，表面电荷在pH 7.4下呈中性，mRNA包封率超过90%，表观pKa为6.57，与未替换CQ12的常规LNPs无显著差异。将CQ12替换策略扩展至LNPs
MC3和LNPs
ALC-0315时，粒径、PDI、包封率和pKa均未发生明显改变。
**AUDI-LNPs的自噬抑制功能**：GFP-RFP-LC3双荧光系统显示，AUDI-LNPs处理6小时后细胞内出现大量黄色斑点（自噬体/两性体），而常规LNPs组以红色斑点（自噬溶酶体）为主，提示自噬体-溶酶体融合被阻断。流式细胞术证实AUDI-LNPs处理的GFP阳性细胞比例和平均荧光强度均显著高于LNPs和游离CQ+LNPs组。Western blot检测到LC3-II/LC3-I比率上升和p62积累，生物电镜观察到自噬体和两性体增加。Cy5标记RNA共定位实验表明，AUDI-LNPs处理4小时后RNA主要与自噬体标志物共定位而非自噬溶酶体，提示mRNA免于降解性清除。MSI和FITC替换实验共同证明，AUDI-LNPs中CQ12的细胞摄取量显著高于游离CQ，解释了其优于CQ+LNPs的原因。
**体外mRNA递送效率**：在HEK293T、DC2.4、B16、MEK和MLF细胞中，AUDI-LNPs的Luc表达均显著高于LNPs和CQ+LNPs，且呈剂量依赖关系，其中HEK293T细胞提升达5.3倍。AUDI技术对FDA批准的SM-102、MC3、ALC-0315三种LNP配方均有效；mEGFP作为第二种报告mRNA验证了递送普适性。内体逃逸定量分析显示，AUDI-LNPs处理6小时后的胞质弥散红色信号明显多于LNPs，提示其延长了mRNA在内体/自噬体中的逃逸时间窗口。在自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和自噬抑制剂氯化铵（NH
4Cl）处理的异常自噬模型中，AUDI-LNPs在两种条件下均维持较高递送效率，进一步验证自噬溶酶体通路在mRNA降解中的关键作用。
**体内多种给药途径的mRNA递送**：BALB/c小鼠皮下注射mLuc负载的AUDI-LNPs后，注射部位荧光信号在2、12和24小时均高于LNPs和CQ+LNPs，12小时差异最显著。C57BL/6小鼠气管内给药同样复现增强表达，器官成像显示肺部信号显著增强。静脉注射后，肝脏和脾脏的Luc活性显著提高，且在尿酸盐氧化酶（urate oxidase，Uox）mRNA高尿酸血症模型中实现更优降血清尿酸效果。生物安全性评估显示肝功能标志物（ALT、AST、ALB、ALP）、肾功能标志物（BUN、CREAT）和组织病理学检查均无明显异常。
**AUDI-LNPs递送IL-10 mRNA治疗银屑病**：在咪喹莫特（imiquimod，IMQ）诱导的银屑病样小鼠模型中，皮下注射IL-10 mRNA@AUDI-LNPs后，鳞屑评分降低72.73%，红斑评分降低83.33%，皮肤厚度改善53.5%，PASI评分显著低于模型组和对照组。血清中TNF-α和IL-6水平回落至接近健康对照，免疫组化染色证实皮肤组织炎症因子表达减少。组织学分析显示表皮棘层增厚、角化过度和角化不全等银屑病特征明显逆转。
**AUDI-LNPs递送TGF-β mRNA治疗急性肺损伤**：在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）气管滴注诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型中，TGF-β mRNA@AUDI-LNPs单次气管内给药后，肺功能参数（吸气容量、呼吸系统阻力、弹性、牛顿阻力和组织阻尼）几乎恢复至健康对照水平；肺湿干重比从5.84 ± 0.18降至4.52 ± 0.25，与健康肺（4.23 ± 0.15）无显著差异。大体标本和H&E染色显示肺泡间隔变薄、气腔重新开放、透明膜溶解，TNF-α和IL-6免疫组化染色证实损伤驱动因子接近完全沉默。
讨论部分指出，自噬溶酶体降解长期是纳米颗粒递送mRNA被低估的汇点。与既往物理共包封游离CQ的策略相比，共价脂质化方法将自噬抑制功能直接嵌入可电离类脂质结构，保证了抑制剂与mRNA货物的共定位和同步释放。AUDI作为即插即用模块，在不改变核心配方的条件下即可将现有LNPs转化为高产mRNA载体，在5种细胞系、两种小鼠模型和三种mRNA货物中实现约5倍蛋白表达提升，且安全性指标与母体LNPs一致。该机制的普适性体现于同一脂质体可兼容MC3、ALC-0315和SM-102三种FDA批准的LNP配方。研究同时指出其局限性：AUDI依赖瞬时自噬抑制，不适用于需要自噬清除病理蛋白的疾病，如某些神经退行性疾病。研究结论总结如下：AUDI将自噬溶酶体降解从不可回避的屏障转变为可调的设计参数，为下一代mRNA疗法提供了通用化工具，在预防性疫苗、体内蛋白生产和CRISPR基因编辑等应用领域具有广阔转化前景。
