《Cell Genomics》：Intraspecific sequence variation and complete genomes refine the identification of rapidly evolved regions in humans
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人类与其他类人猿在表型上存在显著差异，但不完整的参考基因组以及仅用单一基因组组装代表一个物种的做法，限制了对相关遗传改变的精确鉴定。研究人员比对了跨越类人猿分歧与变异的20个端粒到端粒（telomere-to-telomere，T2T）基因组组装，定义了1,5
人类与其他类人猿在表型上存在显著差异，但不完整的参考基因组以及仅用单一基因组组装代表一个物种的做法，限制了对相关遗传改变的精确鉴定。研究人员比对了跨越类人猿分歧与变异的20个端粒到端粒（telomere-to-telomere，T2T）基因组组装，定义了1,596个Consensus HAQERs（consensus human ancestor quickly evolved regions，共识人类祖先快速进化区域），即人类-黑猩猩祖先与现代人类祖先节点之间快速分化的区域。与之前的HAQER集合不同，Consensus HAQERs整合了种群变异，从而降低了种内变异被误判为种间分歧的可能性。Consensus HAQERs表现出升高的突变率、古代正选择（ancient positive selection）和二价调控功能（bivalent regulatory function）的特征；富集于疾病相关位点；并且经常出现在以往无法解析的重复DNA中。通过多重单细胞增强子分析，研究人员将HAQERs鉴定为发育中大脑和心肌细胞中的活性增强子，并强调它们可能对跨多种组织的人类特异性基因调控作出贡献。
研究背景与目的：人类与黑猩猩分离后经历了皮层扩张、认知增强以及神经退行性和神经精神疾病易感性等表型演化。虽然人类与黑猩猩之间存在数千万突变，但只有少数突变对种属特异性性状有重要贡献。已有研究关注人类加速区（human accelerated regions，HARs），但HARs以哺乳动物保守为前提，检测的是已有功能元件的改造；而人类祖先快速进化区（human ancestor quickly evolved regions，HAQERs）不预先要求保守性，可代表从头形成的调控元件。早期HAQER鉴定依赖单个参考基因组和缺口基因组组装（gapped assemblies），无法区分固定差异与种内多态，且缺少着丝粒、端粒等重复序列。为此，研究人员利用新近出现的T2T完整基因组，构建20-way比对，将种内变异纳入分析，定义Consensus HAQERs。
研究方法概述：研究人员以hs1/T2T-CHM13为参考，构建20个T2T基因组的全基因组比对，样本包括7个人类单倍型（HG002母源/父源、汉族CN1母源/父源、YAO母源/父源、Han1）和12个非人猿类单倍型（黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩、苏门答腊猩猩、婆罗洲猩猩、合趾猿各主/交替单倍型）。通过固定拓扑系统发育模型推断祖先序列，用概率向量与余弦距离量化人类-黑猩猩祖先和人类祖先节点间的分歧，在500 bp窗口内用严格统计阈值鉴定快速进化区。结合重复元件富集、突变率估计、固定/多态位点比例、染色质状态（ChromHMM）和全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）富集分析，并采用单细胞自主转录活性调控区测序（single-cell self-transcribing active regulatory region sequencing，scSTARR-seq）在发育小鼠脑和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）来源心肌细胞中验证增强子活性。
20-way T2T比对覆盖类人猿分歧与变异：研究人员将20个T2T组装比对到hs1，T2T组装连续性显著高于之前缺口组装，新增数百Mb以往缺失的序列，为探索重复区和未组装区的快速进化元件奠定基础。
整合种内变异鉴定快速进化基因组区域：通过以人类祖先节点代替现代人类参考基因组计算分歧，得到1,596个Consensus HAQERs，约占1.7 Mb（0.05%基因组）。与Gapped HAQERs和T2T HAQERs相比，Consensus HAQERs减少了种内多态被误判为种间分歧的风险，且新发现的Consensus HAQERs在着丝粒和端粒附近显著富集。
HAQERs表现出升高的突变率：HAQERs在SVA（SINE-VNTR-Alu）等重复元件、简单重复和节段重复中富集；利用局部de novo突变率图谱估计，HAQERs的平均突变率显著高于随机中性对照区（random neutral proxy genomic regions，RAND），而HARs和ENCODE候选顺式调控元件（candidate cis-regulatory elements，cCREs）与基因组背景无显著差异，表明升高的局部突变率驱动HAQERs快速进化。
HAQERs表现出古代正选择特征：HAQERs中人类-猿类分歧位点中多态比例显著低于RAND，固定分歧位点比例高；将分歧标准化为突变率后仍异常高，且存在高频衍生等位基因和回复突变特征，符合古代正选择；在去除重复元件的Consensus HAQERs子集中这一信号仍然存在，排除了比对偏差的干扰。
HAQERs富集于二价染色质状态：在Roadmap 127个参考表观基因组中，HAQERs富集于二价增强子/启动子、多梳抑制区和ZNF/重复状态；在833个EpiMap表观基因组中，主要富集于神经、生殖、心血管和胃肠道等组织的二价状态。不同窗口大小分析显示，约200 bp至1 kb窗口的增强子和启动子富集最强，提示该尺度可能是调控进化的重要单位。
HAQERs富集于疾病相关位点：Consensus HAQERs与GWAS Catalog位点富集分析显示，其与神经母细胞瘤、精神疾病、结直肠癌和甲状腺素水平等相关，且这些疾病类别与上述二价状态富集的组织相一致。
多个HAQERs是神经发育中的活性增强子：研究人员将8个HAQERs克隆进scSTARR-seq载体，经在体胚胎电转导入E14.5小鼠胚胎皮层，2天后分选GFP阳性细胞进行单细胞RNA测序；7个Consensus HAQERs在假bulk分析中显示显著增强子活性，并在兴奋性发育谱系的5种细胞类型中均有活性。其中HAQER0043与DLGAP2基因外显子重叠，DLGAP2在发育中人类皮层兴奋性神经元中表达。
HAQERs是人类心脏发育中的活性增强子：在iPSC来源心肌细胞中转入STARR-seq文库并测序5,648个单细胞，8个候选HAQERs中有5个表现显著增强子活性。其中HAQER1109与BDH1基因3′非翻译区（untranslated region，UTR）重叠，BDH1参与酮体代谢并在心力衰竭中缓解氧化应激。
讨论与结论：讨论指出，T2T基因组使以往无法分析的重复区成为可比较对象，但着丝粒/端粒等区域仍难以比对；当前T2T人类单倍型缺乏非洲祖先样本，可能略微高估人类特异性分歧，但相对人类-黑猩猩约600至700万年的分歧时间影响有限。HAQERs的突变和选择往往共同作用；基因转换可能模拟选择信号，87个Consensus HAQERs（5.5%）与预测的GC偏好基因转换区重叠。功能实验证明HAQERs在脑和心肌中作为增强子，结合GWAS富集支持其影响人类表型与疾病易感性。综上所述，Consensus HAQERs是分离人类与其他类人猿的1,596个快速进化区域目录，其中包含人类改变的基因调控元件，并可能构成人类特异性性状和疾病易感性的基础。
