《Cell Reports Medicine》：Genome-wide cell-free DNA methylation profiling via TAPS for moyamoya disease diagnosis and postoperative collateral formation prediction
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烟雾病（moyamoya disease，MMD）缺乏可靠的生物标志物，难以将其与动脉粥样硬化性脑血管病（atherosclerotic cerebrovascular disease，ACVD）区分开来，也难以预测术后侧支循环形成（postoperative
烟雾病（moyamoya disease，MMD）缺乏可靠的生物标志物，难以将其与动脉粥样硬化性脑血管病（atherosclerotic cerebrovascular disease，ACVD）区分开来，也难以预测术后侧支循环形成（postoperative collateral formation，PCF）。在本研究中，研究人员将低起始量、免亚硫酸盐转化的TET辅助吡啶硼烷测序（TET-assisted pyridine borane sequencing，TAPS）应用于血浆细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），样本来源于发现队列中的39例MMD患者和37例ACVD患者，以及外部多中心队列中的40例MMD患者和16例ACVD患者。相同的文库可用于分析甲基化、片段化、末端核苷酸组成、核小体定位及组织来源信号。尽管整体甲基化谱和组织来源谱大致相似，但差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs）能够将MMD与ACVD区分开来，并与PCF相关。一个基于cfDNA甲基化的模型在发现队列和外部队列中分别取得了0.923和0.822的曲线下面积（areas under the curve，AUCs），而另一个独立模型预测PCF的AUCs分别为0.907和0.854。上述发现为cfDNA甲基化分析作为一种微创方法用于MMD诊断和术前评估提供了概念验证证据，同时也为后续研究建立了表观基因组学资源。
**一、研究背景与科学问题**
烟雾病（moyamoya disease，MMD）是一种罕见的非动脉粥样硬化性脑血管病变，以颈内动脉末端进行性狭窄和脆弱的颅底侧支血管生成为主要特征，可导致反复缺血性或出血性卒中，致残率高。目前数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）仍是诊断金标准，但其有创性、风险和费用限制了筛查与早期诊断。临床实践中，MMD与动脉粥样硬化性脑血管病（atherosclerotic cerebrovascular disease，ACVD）的鉴别存在困难，尤其当烟雾血管发育不成熟或年轻患者合并动脉粥样硬化危险因素时。此外，动脉粥样硬化相关的烟雾样血管病（atherosclerosis-associated moyamoya vasculopathy，AS-MMV）在造影上与MMD高度相似，然而两者血运重建疗效存在差异，提示需要更具生物学依据的诊断工具。术后侧支循环形成（postoperative collateral formation，PCF）是血运重建效果和预后的重要指标，但术前难以准确预测。已有临床和流行病学观察提示，单纯序列变异并不能完全解释MMD的发病，性别差异、单卵双生子表型不一致、亲源效应及地域差异等均提示表观遗传机制参与其中。DNA甲基化作为调控启动子、增强子等顺式元件的关键表观遗传修饰，参与血管发育、血管生成和重构，与MMD的进行性动脉狭窄及异常血管网络形成密切相关。然而，MMD中全基因组cfDNA甲基化图谱及其与PCF的关联尚未得到充分表征，诊断和预后价值不明确。为此，研究人员开展了本研究。
**二、研究内容与主要技术方法**
本研究为多中心、回顾性、概念验证性生物标志物研究。发现队列纳入武汉大学中南医院2022年4月至2023年7月的连续MMD（n = 67）和ACVD（n = 55）患者，外部验证队列来自南京鼓楼医院、广东三九脑科医院和海南省第二人民医院（2024年9月至2025年7月，n = 56）。研究采用TET辅助吡啶硼烷测序（TAPS），一种免亚硫酸盐转化的单碱基分辨率甲基化测序技术，以5 ng cfDNA起始量构建文库，对筛选后的39例MMD和37例ACVD（发现队列）以及40例MMD和16例ACVD（外部队列）进行全基因组甲基化、片段化、末端核苷酸组成、核小体定位和组织来源信号的多模态分析。与亚硫酸盐测序或酶法甲基化测序相比，TAPS减少DNA降解并保持序列复杂度，适合低输入量cfDNA分析。另外，研究人员收集了12例MMD患者术中大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）血管壁标本进行RNA测序（RNA-seq），并纳入既往发表的MCA转录组数据（HRA002011）用于整合分析。功能富集分析采用Metascape，共甲基化网络分析采用CEMiTool，差异甲基化区域（DMRs）鉴定采用metilene，模型构建采用PyCaret逻辑回归，并通过系统性文献回顾（1960年1月至2024年9月，共57项研究）辅助生物学信息引导的标志物筛选。
**三、主要研究结果**
**cfDNA水平反映MMD临床亚型和疾病分期：** 血浆cfDNA浓度在MMD与ACVD间无显著差异，但出血型MMD患者cfDNA浓度显著高于缺血型患者，且cfDNA水平随Suzuki分期变化，IV期最高（单因素方差分析F (4, 62) = 8.47，p = 1.61 × 10
?5），提示cfDNA负荷与MMD临床表现和疾病分期相关。
**MMD与ACVD的全局cfDNA片段组学特征大致相似：** 两组样本均呈现典型约166 bp单核小体峰和约10 bp周期性；整体片段长度分布相似（Kolmogorov-Smirnov D = 0.032，p = 0.095），但MMD组G末端片段富集，ACVD组T末端片段富集，且在校正协变量后差异仍显著，提示MMD中核酸酶切割偏好发生改变。
**cfDNA保留反映颅内基因表达状态的核小体特征：** 窗式保护分数（windowed protection score，WPS）分析显示MMD和ACVD样本均呈现典型启动子核小体足迹；将cfDNA核小体足迹与MCA RNA-seq数据整合后发现，高表达基因核小体相位更强，且核小体足迹强度随转录活性递增而增强，表明cfDNA保留了与染色质组织和转录活性相关的核小体定位模式。
**MMD和ACVD患者整体cfDNA甲基化及细胞类型来源稳定：** 全基因组CpG甲基化水平在MMD（75.72%）与ACVD（75.66%）间几乎一致，组织来源分析显示粒细胞为主要来源，其次为肝细胞和B细胞，两组整体组织构成相似，仅表皮角质形成细胞来源存在名义差异；而PCF不良组T细胞来源cfDNA轻度升高。
**cfDNA甲基化图谱揭示MMD病理生理学背后的表观遗传程序：** 经协变量校正后共鉴定4,885个MMD相关DMRs（FDR < 0.05）。高甲基化DMRs富集于细胞黏附、细胞连接组装、肌动蛋白细胞骨架动力学和血管发育通路；低甲基化DMRs富集于血液循环调节、血管生成、间充质分化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重构通路。共甲基化网络分析鉴定ESR1为核心枢纽基因。随Suzuki分期进展，Cluster 1（1,745个DMRs）呈进行性低甲基化，富集于平滑肌细胞行为、ECM调节、侧支萌芽和血流动力学适应通路，ITGA1呈逐级低甲基化；Cluster 2呈进行性高甲基化，富集于细胞-细胞黏附、连接组织和MAPK-ERK信号通路，SEMA5A呈早期低甲基化后期高甲基化的动态模式。
**探索性cfDNA甲基化-表达整合揭示MMD颅内血管程序的相关性：** cfDNA甲基化与MCA RNA-seq读数在基因组区域上呈负相关（r = ?0.276，p < 0.001），启动子和增强子区域相关类似；重叠基因包括ROCK1、SEMA4A、JCAD、DSG2、NAMPT、COL6A3、COL8A1和FBLN5等血管相关基因，GO富集分析提示血管生成、血管形态发生、脉管系统发育调控等通路。
**cfDNA甲基化分类器区分MMD与ACVD：** 经文献引导的特征选择，最终选取10个DMRs构建逻辑回归诊断模型。发现队列10折交叉验证AUC为0.923（95% CI，0.856–0.979），敏感度84.6%，特异度97.3%；外部验证队列AUC为0.822（95% CI，0.697–0.923）。模型评分在多变量校正后仍与MMD显著相关（校正OR = 6.521；95% CI，2.050–31.081；p = 0.006）。在公共非脑血管病（non-CeVD）TAPS数据集中AUC为0.772，表明诊断信号不局限于MMD与ACVD的比较。
**cfDNA甲基化图谱揭示与MMD患者PCF结局相关的免疫-血管重塑程序：** 经mRS校正后鉴定3,026个PCF相关DMRs。PCF良好组高甲基化DMRs富集于白细胞、T细胞和血小板相关免疫炎症反应通路（如IL1B、IL15、C5AR1、PLCG2），低甲基化DMRs富集于细胞连接组织、细胞骨架重塑和细胞-细胞黏附通路（如PECAM1、ROBO1、SEPTIN7、CDH12），提示良好的侧支形成与炎症信号减弱及内皮完整性和结构重塑程序相对激活有关。整合分析发现PCF相关DMRs与MCA RNA-seq差异表达基因存在交集（如IL1R1、IL1RAP、HCK、ANGPTL2、FGF9、SMURF2、CDH23），进一步支持不良PCF与更强的炎症特征相关。
**cfDNA甲基化模型实现MMD患者PCF术前预测：** 基于相同策略构建PCF特异性10-DMR模型。发现队列5折交叉验证AUC为0.907（95% CI，0.791–0.991），敏感度88.5%，特异度92.3%；外部验证队列AUC为0.854（95% CI，0.725–0.952）。多变量校正后模型评分仍与PCF结局显著相关（校正OR = 4.040；95% CI，1.757–12.861；p < 0.001）。
**四、讨论与结论**
本研究的核心贡献在于将TAPS技术应用于MMD这一临床问题，而非开发新的计算方法。既往MMD甲基化研究主要基于亚硫酸盐转化芯片，仅覆盖不到1%基因组且降解DNA，限制了在低起始量片段化cfDNA中的应用。TAPS可在同一cfDNA文库中实现甲基化、片段化和核小体定位的多模态分析。与既往芯片研究报道缺血性MMD相对健康对照存在全局高甲基化不同，本研究观察到MMD与ACVD间全局CpG和非CpG甲基化无显著差异，提供了更全面的甲基化变化视图。组织来源分析未显示内皮或血管平滑肌细胞的主要贡献，因此血浆cfDNA不能被视为病变颅内动脉的直接读数，但协变量校正后DMRs仍富集于血管结构完整性、血管生成、循环调节和ECM重塑等MMD核心病理生理过程，提示跨组织关联提供生物学背景而非直接调控证据。PCF相关甲基化谱提示免疫调节与侧支重塑之间的关系：PCF不良组T细胞来源cfDNA轻度升高，且PCF良好组高甲基化DMRs富集于T细胞相关通路，结合活化T细胞可分泌CXCL9、CXCL10和CXCL11等抑血管生成趋化因子的既有证据，提示适应性免疫激活的减弱可能有利于侧支形成。局限性方面，本研究为回顾性横断面设计，不能确定甲基化变化的因果作用；样本量相对有限；RNF213基因型数据和家族史数据不完整，无法系统比较遗传相关或家族性MMD与散发病例的差异；片段组学分析主要聚焦于全局特征，未全面评估区域特异性片段化模式。
研究结论：本研究提供了概念验证证据，支持cfDNA甲基化分析作为一种微创方法用于MMD的分子诊断和术前评估。10标志物诊断模型可在发现队列和外部验证队列中区分MMD与ACVD，PCF预测模型可在术前识别与术后侧支循环形成相关的cfDNA甲基化模式。外周血cfDNA甲基化分析为MMD的诊断和术前评估提供了微创且临床可行的方法，为未来机制研究和转化应用奠定了基础。
