《mSphere》：Brucella abortus egresses from host cells in infective clusters through an actin-dependent mechanism
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流产布鲁氏菌（Brucella abortus）是一种胞内病原体，其细胞周期包括黏附、内化、运输、复制和从宿主细胞逸出。尽管布鲁氏菌的胞内生命周期已被广泛研究，但其从宿主细胞逸出的机制仍不清楚。在这项工作中，研究人员通过观察感染72小时后具有自噬特征的含布鲁氏
流产布鲁氏菌（Brucella abortus）是一种胞内病原体，其细胞周期包括黏附、内化、运输、复制和从宿主细胞逸出。尽管布鲁氏菌的胞内生命周期已被广泛研究，但其从宿主细胞逸出的机制仍不清楚。在这项工作中，研究人员通过观察感染72小时后具有自噬特征的含布鲁氏菌囊泡（aBCVs）形成显著增加，以及丰富的流产布鲁氏菌细胞外菌簇（BECs），扩展了对这一胞内步骤的认识。在感染后期，细胞中可见通过肌动蛋白聚合延伸的膜突起。纯化的aBCVs和BECs大小相似，且主要呈酸性。这些囊泡展现出紧凑排列的、有序的细菌，包含死亡和活细菌的异质性群体，以及宿主成分，包括LAMP-1和肌动蛋白丝。一部分BECs被不渗透的宿主膜包绕，而另一些则未被包绕。肌动蛋白细胞骨架参与BECs的突起，因为Rho GTPases的调节影响了胞内aBCV的形成和BECs的逸出。从细胞突起的BECs侵入未感染细胞，启动新一轮感染周期。BECs的拓扑结构和功能强调了它们在布鲁氏菌生命周期中作为细菌传播至宿主细胞和器官载体的重要性。
重要性：流产布鲁氏菌是一种胞内病原体，它被运输至内质网并在其中复制。然而，布鲁氏菌如何逸出宿主细胞并感染新细胞的机制仍知之甚少。研究人员的研究结果表明，突起的酸性自噬样囊泡含有紧凑、有序的布鲁氏菌菌簇，通过GTPase依赖的肌动蛋白丝募集从细胞脱落。通过这一过程，囊泡对抗体和抗生素等物质不渗透，并且对邻近细胞具有高度感染性。这一机制加深了对众所周知的布鲁氏菌逃避免疫系统并建立有害持久感染的“隐身”策略的理解。
流产布鲁氏菌（Brucella abortus）是一种兼性胞内病原体，其胞内周期涉及黏附、内化、运输、复制与逸出等多个环节。感染后，细菌被包裹在含布鲁氏菌囊泡（BCV）中，依次经历早期酸化内体样囊泡（eBCV）、内质网来源的复制性囊泡（rBCV），并最终形成具有自噬特征的含布鲁氏菌囊泡（aBCV）。尽管BCV的胞内运输和复制机制已有较多研究，但布鲁氏菌如何从宿主细胞中逸出并传播至新细胞仍不明确。以往认为细菌可通过细胞裂解释放单个菌体，或经自噬样囊泡与质膜融合以非裂解方式逸出，但逸出囊泡的结构、组成及其驱动机制缺乏系统阐述。为此，研究人员开展本研究，动态追踪布鲁氏菌感染后期的逸出过程，明确逸出菌簇的生成机制、理化性质及生物学功能。
研究人员以HeLa细胞（ATCC CCL-2）和巨噬细胞为感染模型，使用流产布鲁氏菌2308W及其表达红色荧光蛋白（RFP）或绿色荧光蛋白（GFP）的衍生菌株，结合荧光显微镜、共聚焦显微镜、扫描电镜、透射电镜、活细胞成像和菌落计数等方法，系统分析感染后不同时间点的细菌分布和逸出现象。研究还采用大肠杆菌细胞毒性坏死因子（CNF）激活Rho亚家族GTPases、艰难梭菌毒素B抑制GTPases以及细胞松弛素B破坏肌动蛋白细胞骨架，验证这些因子在菌簇突出和逸出中的作用。通过非渗透性抗体染色、LysoTracker酸性示踪、LAMP-1免疫标记和死活细菌鉴别等技术，对纯化的aBCVs和细胞外菌簇（BECs）的膜完整性、酸碱度、标志物表达及菌群活性进行了表征。
研究结果部分按照原文小标题分述如下：
1. **流产布鲁氏菌从宿主细胞逸出随时间呈动态变化**：通过对感染后6至96 h的胞内外细菌计数，研究人员发现逸出是一个动态过程，并随细菌复制增强；感染后72 h逸出量达到峰值。
2. **流产布鲁氏菌在胞内呈两种不同复制模式**：荧光显微镜观察显示，感染24至66 h期间，70%–100%含复制菌的细胞中细菌均匀分散于胞质；72 h后，约56%的感染细胞中出现aBCVs，表明自噬样囊泡的形成与感染后期密切相关。
3. **感染后期流产布鲁氏菌从细胞突出**：扫描和透射电镜及荧光成像显示，细菌可单个或成簇突出，形成大小不一的BECs。BECs可裸露或被宿主膜包绕，菌簇内细菌紧密有序排列，并由细丝样结构相互连接。感染后80–83 h，约20%的感染细胞出现BECs突出。该过程不受庆大霉素影响，提示膜包被的BECs具有保护性屏障。在巨噬细胞中也观察到BECs，支持该机制的普适性。
4. **宿主来源膜包绕相当比例的BECs和aBCVs**：在非渗透条件下，用抗布鲁氏菌LPS-FITC抗体对纯化囊泡染色，约30%的BECs不被标记，表明其外被抗体不可渗透的宿主膜；麦胚凝集素染色进一步证实了膜结构的存在。
5. **BEC和aBCV的大小与形态**：共聚焦测量显示，每个囊泡可容纳约10至650个细菌，多数少于300个。依据短杆菌在球形表面密堆积理论模型，不同大小的菌簇呈现多面体或球形排列，且超过250个细菌的较大囊泡较少见。
6. **BECs和aBCVs含有异质性流产布鲁氏菌群体**：利用脱水四环素（ATc）诱导型GFP菌株及碘化丙啶（PI）染色，研究人员发现BECs中约82%为活菌、约18%为死菌，少数活菌代谢不活跃；未检测到GFP阳性与PI阳性双阳性细菌，排除了膜破损菌的干扰。
7. **BECs和aBCVs呈酸性且富含LAMP-1**：LysoTracker染色显示接近100%的BECs为酸性；所有检测的aBCVs和BECs均表达溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），说明BECs来源于aBCVs并保留了其酸性和膜标志特征。
8. **BEC突出与肌动蛋白细胞骨架聚合相关**：扫描电镜观察到感染细胞出现大量细长的胞质延伸，未感染细胞中则较少；荧光染色显示aBCV膜和突出的BECs均与鬼笔环肽标记的肌动蛋白丝共定位，证明肌动蛋白参与了BECs的突出过程。
9. **Rho亚家族GTPases促进aBCV形成和BEC突出**：CNF激活Rho GTPases可显著增加aBCV形成和BECs突出；艰难梭菌毒素B抑制GTPases则减少BECs突出；细胞松弛素B破坏肌动蛋白后细菌释放减少。电镜结果显示CNF促进膜丝状物和BECs形成，而毒素B则相反。
10. **BECs含有具感染性的布鲁氏菌**：活细胞成像显示，接近100%的BECs可启动新一轮感染，且不受庆大霉素影响；带有突出BECs的感染细胞存活时间明显长于未感染细胞，表明布鲁氏菌通过延长宿主细胞寿命来支持持续的菌簇释放和传播。
讨论部分指出，布鲁氏菌逸出是一个非裂解性的主动过程。aBCVs经Rho GTPase激活和肌动蛋白聚合介导的膜突起，以BECs形式释放。BECs的宿主膜包绕可形成物理屏障，解释了对庆大霉素和抗体的抵抗性。菌簇内死菌可能提供黏附支架，促进细菌聚集和微菌落形成。BECs的酸性和LAMP-1特征与维持细菌毒力有关。该过程与衣原体逸出机制类似，但布鲁氏菌囊泡具有自噬体特征。膜包被的BECs可能被吞噬细胞摄取后抑制促炎信号，从而帮助细菌逃避免疫识别，建立持久感染。研究结论是：流产布鲁氏菌以aBCVs形式经Rho GTPases和肌动蛋白依赖机制从宿主细胞逸出，形成的BECs是细菌在宿主内传播并逃避免疫攻击的重要载体。
