跨组织单细胞转录组整合分析揭示CCL2-CCR2信号通路作为神经病理性疼痛潜在治疗靶点

《Journal of Pain Research》：An Integrated Multi-Tissue Single-Cell Transcriptomic Analysis Highlights the CCL2-CCR2 Signaling Pathway as a Potential Therapeutic Target in Neuropathic Pain

　　

背景：神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）涉及躯体感觉神经系统复杂的神经免疫相互作用，但目前仍缺乏全面的多组织细胞图谱。 方法：研究人员整合了 spared nerve injury（SNI）小鼠坐骨神经（sciatic nerve, SN）、背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）和脊髓（spinal cord, SC）的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，并在体内评估了选择性CCR2拮抗剂RS504393的治疗潜力。 结果：巨噬细胞在损伤的坐骨神经中占主导地位（40.5%），表现出从驻留样Mrc1+表型向促炎性Ccl2+/Spp1+亚型转变的推断性转录变化。损伤提高了SN巨噬细胞和脊髓小胶质细胞的糖酵解活性，但抑制了DRG神经元的代谢。细胞间通讯分析预测在疼痛组中，从外周巨噬细胞到感觉神经元的CCL2-CCR2信号增强。在体内，RS504393给药显著减轻了机械性和热痛觉过敏，减少了脊髓炎症浸润，并抑制了小胶质细胞活化。 结论：本研究提供了神经病理性疼痛的多组织单细胞整合分析，并强调CCL2-CCR2信号通路作为外周神经免疫界面上潜在的非阿片类治疗靶点，药理学证据提示其具有下游中枢效应。 关键词：单细胞RNA测序；外周神经损伤；坐骨神经；背根神经节；CCL2-CCR2信号通路

一、研究背景与科学问题

神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是由躯体感觉神经系统病变引起的慢性疼痛综合征，具有显著的表型和遗传异质性，现有治疗手段常因病理机制复杂而难以达到满意疗效。NP的发生发展涉及外周及中枢神经系统中神经免疫相互作用与慢性神经炎症。坐骨神经损伤（spared nerve injury, SNI）模型被广泛用于解析这些基础机制。在NP发病过程中，坐骨神经（sciatic nerve, SN）、背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）和脊髓（spinal cord, SC）构成伤害性信号传导的关键解剖节点：损伤后SN局部发生华勒变性和大量免疫细胞浸润；DRG经历深刻的转录重编程，参与外周敏化；SC背角通过胶质细胞活化诱导中枢敏化。这三个节点沿伤害性轴在解剖和功能上相互连接，为跨组织整合分析提供了生物学基础。然而，目前仍缺乏将外周损伤部位与中枢投射区域联系起来的全面细胞图谱。既往单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）研究虽已分别表征了损伤SN中的免疫应答、DRG卫星胶质细胞的转录变化以及慢性疼痛下脊髓胶质细胞动态，但均未考察沿SN–DRG–SC信号通路的跨组织神经免疫相互作用。此外，巨噬细胞代谢转变如何驱动疼痛维持仍未阐明，介导外周神经向中枢神经系统跨组织信号传导的特异性网络也需进一步表征。因此，本研究旨在探讨跨组织细胞通讯和巨噬细胞代谢转变在NP中的价值。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员整合了来自NCBI GEO数据库的三个独立scRNA-seq数据集：SN数据集GSE153762（仅疼痛组，n=3，SNI后3天）、DRG数据集GSE174430（对照组n=1；疼痛组n=2）和SC数据集GSE208766（对照组n=2；疼痛组n=2），共保留37,642个细胞。主要技术方法包括：使用Cell Ranger比对至mm10小鼠基因组，Seurat进行质量控制、标准化和主成分分析，Harmony进行批次效应校正；采用Leiden算法进行无监督聚类，UMAP进行二维可视化；SingleR和scMayoMap辅助细胞类型注释；AUCell和UCell进行代谢通路及疼痛相关基因集活性评分；Monocle3进行SN巨噬细胞拟时序轨迹推断；WGCNA构建DRG神经元基因共表达网络；decoupleR经VIPER和DoRothEA调控子推断转录因子活性；CellChat分析跨组织细胞通讯。在体内验证中，研究人员建立SNI小鼠模型，于术后第3天起每日皮下注射选择性CCR2拮抗剂RS504393（3 mg/kg）至第14天，通过von Frey纤维丝和辐射热装置评估机械性痛觉过敏和热痛觉过敏，采用HE染色和免疫荧光双标（CCR2与IBA1）检测脊髓炎症浸润和小胶质细胞活化。

三、研究结果

1. 1.
   损伤后巨噬细胞主导坐骨神经细胞图谱

UMAP可视化显示SN、DRG和SC组织间以及疼痛组与对照组间细胞群明显分离。DRG中卫星胶质细胞（satellite glial cells, SGCs）为主要群体（66.2%）；SC中星形胶质细胞（33.8%）、小胶质细胞（31.0%）和少突胶质细胞（25.6%）为主要细胞类型；SN细胞组成最为多样，以巨噬细胞（40.5%，共10,987个细胞）、成纤维细胞（18.4%）和施万细胞（15.1%）为主。细胞类型注释与特异性标志基因表达一致。

1. 2.
   损伤诱导DRG神经元转录重编程及局部免疫和胶质细胞代谢转变

DRG神经元中，疼痛组较对照组有3个基因上调（Neat1、Gm242418、Nfib）、71个基因下调（包括Nptx2、Dnajb1、Trpc3）。疼痛组SN巨噬细胞、SN施万细胞和SC小胶质细胞的糖酵解和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）通路活性升高；独立纵向数据集GSE198582验证了SNI后第3天SN巨噬细胞糖酵解活性较幼稚对照显著升高。相反，疼痛组DRG神经元糖酵解（0.259降至0.188）和OXPHOS（0.344降至0.244）活性评分降低。DRG神经元伤害性基因集活性评分在疼痛组显示部分高活性细胞亚群，但组间差异无统计学意义（P=0.145）。HK2表达在SC小胶质细胞中最高，SN巨噬细胞中中等，DRG神经元中可忽略。

1. 3.
   坐骨神经巨噬细胞显示损伤后向促炎亚型转变的推断性转录排序

SN巨噬细胞在UMAP空间中形成连续推断轨迹，拟时序值从主细胞簇向孤立左上簇递增。鉴定出四个巨噬细胞亚群：Ccl2⁺、促炎性、驻留样和过渡态。Ccl2表达沿拟时序轴增加，在终末分支达峰；Spp1从低至中等拟时序至终末阶段维持高表达；Ccl3在终末区域富集。驻留样标志基因Cx3cr1和Mrc1早期高表达并沿拟时序下调，促炎标志物Ccl2和Il1b在中后期上调，Ccl2在轨迹末端达峰。该推断排序与向炎症状态转变的转录特征一致。

1. 4.
   损伤DRG神经元中ATF3和Jun活性上调与炎症基因模块相关

M7模块与疼痛表型呈最强正相关（Pearson r=0.17，P<0.001），M5模块呈最大显著负相关。疼痛相关模块主要富集于细胞连接解体、小胶质细胞活化、T细胞介导细胞毒性负调控、突触修剪和抗原呈递等GO生物学过程。转录因子ATF3、Jun、STAT3和NF-κB活性评分在疼痛组均高于对照组（均P<0.001），其中STAT3在两组中绝对活性评分最高，ATF3活性从对照组近零升至疼痛组升高水平。

1. 5.
   损伤后经CCL2-CCR2信号通路的巨噬细胞至DRG神经元通讯预测增强

SN巨噬细胞至DRG神经元的促炎性配体-受体对（CCL2–CCR2、CCL3–CCR1、CSF1–CSF1R、IL1B–IL1R1）通讯评分在疼痛组高于对照组，其中CCL2–CCR2增幅最大，Pain/Control倍数变化最高（FC=6.7）。疼痛组约半数SN巨噬细胞表达Ccl2，呈右偏分布；DRG神经元中CCR2⁺细胞比例在疼痛组呈非显著升高趋势（P=0.057）。三个疼痛生物学重复中Ccl2⁺ SN巨噬细胞比例为38.8%–55.2%；DRG神经元Ccr2⁺细胞比例在单一对照重复为1.4%，两个疼痛重复分别为6.2%和3.4%。置换检验证实CCL2–CCR2通讯评分在10,000个随机配体-受体对中排名第96.15百分位（置换P=0.039）。

1. 6.
   CCR2拮抗缓解SNI小鼠神经病理性疼痛并减少脊髓CCR2⁺/IBA1⁺细胞活化

基线机械 withdrawal 阈值和热 withdrawal 潜伏期在各组间相当。术后第3至14天，SNI组机械阈值和热潜伏期较Sham组显著降低。RS504393在第3天未产生显著行为改善，但在术后第7天和第14天显著恢复机械阈值和热潜伏期。SNI组脊髓细胞排列紊乱、炎症细胞浸润显著增加，RS504393治疗显著减轻炎症细胞密度。脊髓背角CCR2、IBA1及CCR2/IBA1共定位荧光强度在SNI组均较Sham显著升高，RS504393治疗后显著降低（均P<0.001）。IBA1同时标记驻留小胶质细胞和浸润性单核细胞来源巨噬细胞，CCR2⁺/IBA1⁺群体代表混合髓系细胞群。

四、讨论与结论

讨论部分指出，单细胞转录组分析揭示巨噬细胞占损伤坐骨神经细胞群的40.5%，表明大量局部免疫浸润。拟时序轨迹分析显示从早期Mrc1⁺驻留样表型向促炎终末亚型转变的转录排序，Ccl2和Spp1在轨迹末端显著富集。DRG感觉神经元表现出高度选择性转录应答，ATF3、Jun和STAT3显著上调，ATF3作为神经应激经典标志在NP进展中发挥核心作用。跨组织代谢评估显示外周浸润巨噬细胞和中枢活化小胶质细胞糖酵解与氧化磷酸化活性同步升高，HK2高表达凸显葡萄糖代谢在驱动疼痛相关神经炎症中的关键作用；相反DRG神经元整体代谢活性显著降低，受损神经元线粒体功能及氧化应激是NP的公认促成因素。CellChat分析识别SN巨噬细胞与DRG神经元间相容的CCL2–CCR2共表达模式，疼痛组预测通讯评分升高。皮下给予CCR2拮抗剂RS504393改善NP行为并减少脊髓背角CCR2⁺/IBA1⁺髓系细胞活化，为外周信号轴与中枢效应相关提供间接证据。但系统性CCR2拮抗影响循环单核细胞、外周巨噬细胞、脊髓浸润细胞及潜在驻留小胶质细胞，无法将镇痛效应归因于特定细胞通路。

研究结论：多组织单细胞转录组学整合与体内验证描绘了由巨噬细胞状态转变、选择性神经元转录重编程和分化代谢适应驱动的系统性NP机制。计算与药理学证据的汇聚将CCL2–CCR2信号通路定位为值得进一步实验研究的候选机制和治疗假说，为开发非阿片类镇痛策略提供依据。