温针通过TAK1/MAPK信号通路减轻膝骨关节炎疼痛相关反应和炎症：基于人类软骨蛋白质组学与实验模型的证据

《Journal of Pain Research》：Warm Needle Acupuncture Attenuates Pain-Related Responses and Inflammation in Knee Osteoarthritis: Evidence for Involvement of TAK1/MAPK Signaling from Human Cartilage and Experimental Models

　　

背景：温针（Warm needle acupuncture, WNA）可改善膝骨关节炎（knee osteoarthritis, KOA）的症状。然而，与其效应相关的分子变化仍不清楚。

方法：本研究结合了人类软骨蛋白质组学、内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus, DMM）大鼠模型和离体原代软骨细胞分析。最终临床分析纳入61例晚期KOA患者（对照组，n=31；WNA组，n=30）。在21天术前干预后收集软骨和滑液。软骨样本进行四维数据非依赖采集（four-dimensional data-independent acquisition, 4D-DIA）蛋白质组学分析，随后进行聚焦于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）相关过程的假设驱动分析。差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）定义为|log₂FC| ≥ 1且名义P < 0.05。采用60只大鼠建立DMM诱导的KOA模型进行体内验证。使用von Frey试验评估机械性疼痛超敏反应，并评估软骨病理、MAPK信号和炎症细胞因子。体内处理后分离原代软骨细胞。离体分析评估转化生长因子-β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1）/MAPK信号和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）。关节内注射白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）作为额外的炎症刺激。

结果：WNA与人KOA软骨中p-TAK1、p-JNK、p-ERK和p-p38的免疫反应性降低相关。滑液中IL-6（P < 0.01）、IL-1β（P < 0.05）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）（P < 0.05）也较低。蛋白质组学鉴定出475个DEPs。聚焦于MAPK的分析显示涉及JNK、ERK1/ERK2和p38 MAPK相关过程的变化。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析还鉴定了炎症通路，包括MAPK、核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）、白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）和TNF信号。在DMM大鼠中，模型建立后机械性缩爪阈值降低。WNA在治疗期间逐渐增加缩爪阈值，与模型组相比，在干预14天和21天后显著改善（均P < 0.001）。WNA还减轻了软骨损伤和OARSI评分（P < 0.001），并伴随TAK1/MAPK信号和炎症细胞因子水平降低。来自WNA处理的DMM大鼠的软骨细胞也显示出较低的TAK1/MAPK信号和IL-6表达。关节内IL-1β减弱了WNA相关的几种分子变化。

结论：WNA与KOA中TAK1/MAPK信号降低以及IL-1β、TNF-α和IL-6水平降低相关。人类软骨蛋白质组学也显示WNA相关MAPK相关过程的变化。总之，这些发现支持TAK1/MAPK相关炎症信号参与WNA的应答。需要直接的功能研究来确定TAK1和各个MAPK分支的因果作用。

试验注册：国际传统医学临床试验注册中心（International Traditional Medicine Clinical Trial Registry, ITMCTR），注册号：ITMCTR2025002585。

关键词：骨关节炎，膝，艾灸，针灸疗法，MAP激酶信号系统，炎症。

膝骨关节炎（KOA）是一种常见的退行性关节疾病。2021年全球疾病负担研究估计全球约有6.07亿人罹患骨关节炎，其中KOA占一半以上，且患病率随年龄增长急剧上升，是老年人疼痛和功能丧失的主要原因。该疾病涉及软骨进行性退变、滑膜炎症和异常炎症信号传导。白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可增强疼痛敏感化并促进基质金属蛋白酶表达，从而加重细胞外基质降解和软骨损伤。已有研究指出，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）系统在软骨细胞炎症、应激反应和基质降解中发挥核心作用，其重要分支包括c-Jun N末端激酶（JNK）、p38 MAPK和细胞外信号调节激酶（ERK）。白细胞介素-6（IL-6）亦与KOA进展相关，可参与软骨分解代谢和炎症性疼痛。温针（WNA）将针刺与艾灸产生的热刺激相结合，临床研究和荟萃分析报告其可改善KOA患者的疼痛和膝关节功能，且实验研究提示针灸相关治疗可影响MAPK和核因子κB（NF-κB）信号。然而，WNA特异性的分子变化仍不清楚，既往机制研究多基于动物或细胞模型，来自人类病变软骨的直接分子证据有限。因此，研究人员开展了本研究，以探究WNA在人体KOA软骨中引发的分子变化。

本研究设计为机制性分析，结合了人类软骨蛋白质组学、内侧半月板失稳（DMM）大鼠模型和离体原代软骨细胞研究。临床部分从上海市光华中西医结合医院前瞻性招募拟行初次全膝关节置换术的晚期KOA患者，随机分为对照组（n=31）和WNA组（n=30），在21天术前干预后收集软骨和滑液。动物实验使用60只Sprague-Dawley大鼠，其中36只用于主要体内实验（Sham、Model、WNA三组，每组12只），24只用于关节内IL-1β刺激的机制实验（每组6只）。DMM模型通过切断内侧半月板胫骨韧带诱导，WNA在造模后8周开始，持续21天。体外实验从体内处理后的动物关节软骨中分离原代软骨细胞，进行离体分析。

主要关键技术方法包括：利用四维数据非依赖采集（4D-DIA）蛋白质组学对15例WNA组和15例对照组的人软骨样本进行定量分析，以|log₂FC| ≥ 1和名义P < 0.05定义差异表达蛋白（DEPs）；采用von Frey纤维丝和上-下法测定大鼠机械性缩爪阈值（PWT）以评估疼痛超敏；通过OARSI评分系统进行组织学评估软骨损伤；免疫组化检测人软骨中p-TAK1、p-JNK、p-p38和p-ERK免疫反应性；Western blot定量大鼠软骨及原代软骨细胞中TAK1/MAPK磷酸化水平；ELISA测定人滑液和大鼠软骨中的IL-1β、IL-6和TNF-α浓度。此外，对DMM大鼠分离的原代软骨细胞进行免疫荧光染色验证SOX9和II型胶原表达以确认为软骨细胞。

研究结果部分包括四个主要发现。第一，“差异化蛋白质组学分析揭示人KOA软骨中WNA相关的MAPK相关生物学过程改变”。4D-DIA分析共鉴定出475个DEPs，其中WNA组232个上调、243个下调；敏感性分析中370个蛋白在Benjamini-Hochberg校正后仍显著（q < 0.05）。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示MAPK调节、炎症反应及NF-κB、IL-17、TNF和细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路富集。聚焦于MAPK的基因集富集分析（GSEA）显示JNK、ERK1/ERK2和p38 MAPK级联及其调节相关基因集富集。第二，“WNA与人类KOA中MAPK通路激活降低和炎症细胞因子水平降低相关”。免疫组化显示WNA组人软骨p-TAK1（P < 0.01）以及p-JNK、p-p38、p-ERK免疫反应性（均P < 0.001）较对照组低；滑液中IL-1β（P < 0.05）、IL-6（P < 0.01）和TNF-α（P < 0.05）也显著降低。第三，“WNA减轻DMM大鼠机械性疼痛超敏和软骨损伤，并伴随TAK1/MAPK信号和炎症降低”。DMM模型建立后PWT显著降低，WNA治疗7天时与模型组无差异，14天和21天后PWT显著高于模型组（均P < 0.001）。WNA治疗组OARSI评分较模型组显著降低（P < 0.001），软骨组织中TAK1、ERK、JNK和p38磷酸化水平及IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著低于模型组。第四，“IL-1β部分逆转原代软骨细胞中WNA相关的TAK1/MAPK信号降低”。从WNA+PBS组分离的软骨细胞中TAK1、ERK、JNK、p38磷酸化和IL-6表达显著低于Model+PBS组；而WNA+IL-1β组中TAK1、JNK、p38磷酸化和IL-6表达较WNA+PBS组升高，其中TAK1磷酸化几乎恢复至模型水平，说明WNA的分子效应可被IL-1β部分抵消。

讨论部分指出，WNA对机械性疼痛超敏的改善呈渐进性而非即时性，且伴随软骨损伤和炎症因子水平下降。研究人员在人类软骨蛋白质组学中观察到MAPK相关过程的协调变化，JNK、ERK和p38分支均参与应答而非单一通路激活。TAK1作为MAPK上游调节因子被验证，其在人软骨和大鼠模型中的磷酸化水平均与WNA相关，但IL-1β的逆转程度在不同标记物间存在差异，提示WNA可能作用于相互连接的多个炎症通路。研究局限包括未直接干预TAK1或各MAPK分支，无法证明因果关系；IL-1β为广谱炎症刺激而非通路特异性恢复；DMM模型和原代细胞难以完全模拟人KOA的复杂环境；临床部分缺乏组分对照、未设定NSAIDs洗脱期，且缺乏治疗前蛋白质组学谱和独立验证队列。未来需要直接通路操作、成分对照和纵向采样研究。

结论部分可翻译为：本研究整合人软骨蛋白质组学、DMM诱导大鼠模型和原代软骨细胞分析，以表征WNA在KOA中相关的分子变化。WNA减轻了DMM大鼠的机械性疼痛超敏，并与临床和实验系统中软骨损伤减少、炎症介质水平降低以及TAK1/MAPK相关信号降低相关。人类蛋白质组学分析也显示MAPK相关过程的协调变化。这些发现支持TAK1/MAPK相关炎症信号参与WNA的应答，但并未建立通路抑制与镇痛之间的直接因果关系。需要直接干预TAK1和各MAPK分支以明确其在WNA生物学和镇痛效应中的具体作用。