《mSystems》：Synthesis-driven reverse metabolomics reveals 3-hydroxy N-acyl amides as gut microbial molecules
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3-羟基N-酰基酰胺（3-hydroxy N-acyl amides）是具有抗肥胖和血糖调节效应的生物活性脂质，然而由于它们在现有谱图参考库中基本缺失，因此在非靶向代谢组学研究中极少被检测到。为解决这一空白，研究人员合成了一个包含436种结构多样的3-羟基N-
3-羟基N-酰基酰胺（3-hydroxy N-acyl amides）是具有抗肥胖和血糖调节效应的生物活性脂质，然而由于它们在现有谱图参考库中基本缺失，因此在非靶向代谢组学研究中极少被检测到。为解决这一空白，研究人员合成了一个包含436种结构多样的3-羟基N-酰基酰胺的串联质谱（MS/MS）谱图资源，涵盖3至18个碳链长度的β-羟基化脂肪酸尾链与多种胺头基团（如鸟氨酸、缬氨酸和多巴胺）。采用基于合成的反向代谢组学（synthesis-driven reverse metabolomics）方法，研究人员在54,744份公开可用的非靶向代谢组学数据文件中发现了161,626次谱图匹配，揭示了这些化合物在包括人类来源样本在内的生物样品中的广泛分布。在这些通过MS/MS谱图匹配检测到的分子中，有334种为新报道的生物实体。研究人员进一步利用保留时间（retention time）和离子淌度（ion mobility）测量，在人类唾液、粪便和皮肤样本中确认了它们的存在。在微生物数据集中的高频检测以及在人类肠道细菌群落中的验证，支持了其微生物来源。多项代谢物在糖尿病患者中表现出丰度改变，表明该类脂质在人类代谢疾病中受到调控。综上，这些发现确立了3-羟基N-酰基酰胺为一类独特且具有生物学意义的脂质类别，所附的MS/MS谱图资源将使其能够在非靶向代谢组学数据中得到更广泛的识别与研究。
研究背景与科学问题
宿主与微生物之间的相互作用产生大量代谢产物，这些代谢物在人类健康和疾病中发挥着重要作用。然而，在非靶向代谢组学研究中，公共数据库中约1.7亿张串联质谱（MS/MS）谱图中仅有8.1%能够匹配到现有的全球天然产物社会分子网络（GNPS）库中的标准谱图，注释率极低。3-羟基N-酰基酰胺是一类由β-羟基化脂肪酸尾链与不同胺头基团通过酰胺键连接而成的脂质分子，已有研究表明其在致病菌毒力因子、宿主免疫信号传导和哺乳动物能量代谢中具有重要功能，例如脑膜炎奈瑟菌来源的3-羟基十四烷酰鸟氨酸、伯克霍尔德菌来源的3-羟基十六烷酰鸟氨酸等均被发现可激活人体免疫通路。然而，这类分子的结构多样性和在不同生物系统中的分布仍基本未知，主要原因是缺乏系统的参考谱图库。为此，研究人员提出采用基于合成的反向代谢组学策略，通过合成标准品建立谱图库，再对公共数据库进行大规模检索，以发现此前未被注释的该类分子。
研究方法与技术路线
研究人员采用多重反应合成法，将19种3-羟基脂肪酸与42种胺头基团组合，理论上可生成798种不同的3-羟基N-酰基酰胺，其中536种被液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测到。经SIRIUS软件辅助子结构注释和人工诊断碎片峰筛选后，最终构建了一个包含436种独特化合物、共726张MS/MS谱图的参考库，命名为“3-HYDROXY-ACYL-AMIDES-LIBRARY”，并上传至GNPS公共库和Zenodo平台。随后，研究人员利用快速质量谱搜索工具（FASST）对该库中的所有谱图进行全库级反向代谢组学搜索，覆盖GNPS/MassIVE、Metabolights和Metabolomics Workbench三大公共存储库中的数据文件。此外，还使用了领域特异性搜索工具microbeMASST、plantMASST和foodMASST进行分类学关联分析。对于在实验室可获得样本的候选分子，研究人员进一步通过保留时间和碰撞截面积（CCS）比对进行正交验证，达到代谢组学标准倡议（MSI）一级鉴定水平。在数据分析方面，研究人员使用MZmine进行特征提取，并在GNPS2平台上进行基于特征的分子网络（feature-based molecular networking）分析，结合威尔科克森秩和检验进行统计显著性评估。
研究结果
谱图库的构建与全库分析
通过多重反应合成，研究人员获得了536种目标化合物的谱图数据，经SIRIUS过滤和人工校验后，最终纳入436种独特化合物。在这些化合物中，仅有3种存在于LipidMAPS数据库中，79种存在于PubChem中，1种在人类代谢组数据库（HMDB）中有记录，而北美质谱库（MONA）中完全没有收录。这表明该谱图库填补了重要的注释空白。在全库级反向代谢组学搜索中，研究人员在54,744个数据文件中获得161,626次谱图匹配（最小余弦相似度≥0.7，最少匹配3个碎片离子），对应334种独特的3-羟基N-酰基酰胺。这些匹配来自1,255项独立研究。按样本来源分类，人类样本中获得3,010次匹配，啮齿类动物2,386次，植物4,278次，微生物6,505次，食物615次。在人类样本中，大脑组织获得的匹配次数最多（1,305次），其次是粪便/肛门样本（531次）、血液（270次）、皮肤（263次）和尿液（146次）。值得注意的是，粪便样本中检测到的化合物多样性最高，涉及11种脂肪酸尾链和22种胺头基团的组合。
3-羟基N-酰基酰胺的微生物来源
利用microbeMASST工具对61,000份分类学定义的微生物单培养数据进行搜索，研究人员发现135种3-羟基N-酰基酰胺谱图（对应111种独特化合物）与微生物数据匹配，其中许多匹配属于人类肠道微生物组的常见菌群（如芽孢杆菌纲和梭菌纲）。为进一步验证微生物来源，研究人员将80株人源肠道细菌按生长速率分为四组（快生长组G1、中快生长组G2、中慢生长组G3和慢生长组G4），在添加了七种3-羟基脂肪酸（C3:0、C4:0、C5:0、C11:0、C12:0、C13:0和C16:0）的脑心浸液培养基中进行厌氧培养。72小时后，快生长组和中快生长组成功产生了多种3-羟基N-酰基酰胺，其中C12:0链的产物最为显著，而在未加细菌的培养基对照中未检测到这些产物。研究人员通过谱图匹配、保留时间和漂移时间比对三重验证，确认了细菌对这些分子的生产能力。
在人类疾病中的潜在作用
研究人员分析了多个公共数据集，发现3-羟基N-酰基酰胺在炎症性肠病（IBD）、原发性细菌感染性疾病（PBID）和糖尿病（diabetes mellitus）等疾病状态中存在差异分布。针对糖尿病数据集MSV000082261（含糖尿病患者和健康对照的尿液样本），研究人员通过基于特征的分子网络分析，发现3-羟基月桂酰谷氨酸及其相关特征在1型糖尿病患者的尿液中显著降低（P < 0.05），表明该类脂质的代谢可能与脂肪酸β-氧化通路的失调有关。在骨关节炎患者队列数据集MSV000094097中，研究人员发现3-羟基戊酰亮氨酸在粪便、血清、血浆和唾液中均有分布，而3-羟基十四烷酰赖氨酸则仅出现在粪便和唾液样本中，显示出组织/体液特异性，支持其微生物来源的假说。在尸体皮肤分解数据集MSV000084322中，3-羟基十四烷酰谷氨酸的丰度随分解时间延长而显著增加（P < 0.05），与微生物增殖趋势一致。此外，在HIV神经行为研究中心（HNRC）的粪便样本中，研究人员验证了此前未报道的3-羟基十八碳烯酰组胺的存在。
结论与展望
本研究通过合成驱动的反向代谢组学策略，大幅扩展了3-羟基N-酰基酰胺这一类长期被忽视的微生物代谢物的注释覆盖率。研究人员建立了包含765张独特MS/MS谱图的公共参考库，并在超过5万份公开数据文件中发现了超过16万次谱图匹配，揭示了该类分子在人类、微生物和植物样本中的广泛分布。通过体外肠道细菌群落培养实验，研究人员证实了细菌可利用外源3-羟基脂肪酸作为底物生产N-酰基酰胺。在疾病关联分析中，研究人员发现该类分子在1型糖尿病患者尿液中显著减少，在尸体皮肤分解过程中显著增加，提示其可能参与宿主-微生物代谢互作。尽管该研究取得了重要进展，但仍存在若干局限性：MS/MS谱图匹配仅为推定鉴定，需正交验证方法确认；由于小分子无法像肽段一样进行反转或重排以生成有效的诱饵库，传统的靶标-诱饵错误发现率（FDR）控制方法不适用，基于异构体映射的估计显示7.3%的谱图匹配可能对应不同离子；谱图库主要基于轨道阱仪器创建，可能偏向于同类仪器的数据；多重反应合成法未进行纯化和核磁共振（NMR）验证。研究人员希望该工作流程和碎片模式知识能被广泛应用于全球代谢组学研究，进一步提升代谢物的注释率。
