单分子水平下的基因表达动态：多色荧光显微术与分子机器研究进展

《Current Opinion in Structural Biology》：Lights, machines, action! Watching gene expression unfold at the single-molecule level

　　

大分子机器（macromolecular machines），例如RNA聚合酶（RNA polymerase, RNAP）和核糖体（ribosome），属于复杂且相互关联的生物学过程。由于其复杂性和动态性质，偶联过程难以完整捕获，因此单分子成像（single-molecule imaging）最适合用于观察相关分子机器的工作状态。近期进展推动单分子技术迈向更复杂的体外（in vitro）系统，采用多色标记，并能够在活细胞中观察分子机器。本综述中，研究人员重点介绍了近期利用单分子荧光显微术（single-molecule fluorescence microscopy），通过复杂的体外重组系统或研究活细胞中基因表达的新策略，来探究与基因表达相关的复杂分子过程的研究。

**研究背景与意义**
生命有机体的复杂性来源于大量相互交织的生物学过程，而这些过程难以整体捕获。在最基础的水平上，生物学过程涉及不同生物分子间相互作用的建立与解除，以及不同构象状态间的转换，其分子机制由生物分子功能决定，而功能又与结构紧密相关。结构研究可通过X射线晶体学、冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）、核磁共振或冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）提供高分辨率信息；新兴的时间分辨结构研究强调连接反应轨迹上各结构态的必要性，但所需的系综平均会丢失过程的随机性，无法实时完整描述多步骤过程。单分子荧光显微术可在时间维度上跟踪动态过程，实时记录构象和组成变化，克服系综平均的限制，捕捉瞬态和稀有中间态，并允许筛选具有活性的分子。近年荧光染料稳定性、标记策略、表面化学、多路成像、仪器和数据分析管线等进展，推动了复杂多步骤生物分子过程的研究。为此，该综述聚焦于利用单分子技术解析细菌和真核系统中与基因表达相关的相互连接过程，以及借助体外重组系统或在活细胞中追踪分子机器作用的代表性工作。

**主要技术方法**
研究人员综述的方法主要包括：基于表面固定的全内反射荧光显微术（total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF），配合多色荧光共定位、F?rster共振能量转移（F?rster-resonance energy transfer, FRET）和蛋白质诱导荧光增强（protein induced fluorescence enhancement, PIFE）来监测分子间相互作用与构象变化；将光学镊子与多色荧光成像联用，施加力并同时观察转录延伸；基于荧光RNA适体阵列的实时体外转录测定（real-time in vitro fluorescence transcription assay, RIFT）用于检测Pol II起始动力学；活细胞单分子追踪利用基因组融合、自标记标签（CLIP/SNAP/HALO）和荧光阵列（如SunTag及无终止密码子环状RNA, socRNA）标记目标；稀疏标记策略（如TRiC 3%、前折叠蛋白9%）用于观察分子伴侣与核糖体互作；以及纳米孔电穿孔实现活细胞内三色单分子跟踪。研究对象包括大肠杆菌、酵母、果蝇及人源线粒体翻译系统等。

**研究结果**

**细菌体外重组系统的单分子研究**
针对核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）共转录核糖体组装，研究人员开发了四色单分子FRET实验，在同一实验中间时追踪六组分rRNA转录抗终止复合物（rRNA transcription anti-termination complex, rrnTAC）在转录延伸复合物上的完整组装、转录延伸和RNase III对新生成RNA的共转录加工。能够识别完全组装的rrnTAC并区别于未组装颗粒，直接关联组装状态与共转录加工活性。还发现转录因子NusA和NusG在rRNA转录期间稳定结合数分钟，而在mRNA转录期间仅结合数秒。此外，DEAD-box解旋酶CsdA通过展开不稳定的rRNA结构并保留稳定结构来加速初级核糖体蛋白S4的结合，核糖体蛋白可协同发挥RNA分子伴侣作用；同时跟踪多达5种颜色，功能表征了8种rRNA分子，显示RNA修饰酶、反义寡核苷酸和核糖体蛋白只影响部分RNA折叠类别。在转录-翻译偶联方面，光学镊子实验表明紧跟的核糖体可对RNAP施加向前机械力，将其推出暂停状态，但以降低转录保真度为代价；研究人员还观察到RNAP-核糖体碰撞后两者物理互作变得更短暂，并且即使中间相隔数百个核苷酸，核糖体也可通过mRNA成环重新激活暂停的RNAP。DNA拓扑方面，转录RNAP诱导正/负超螺旋，多个RNAP通过头对头和同向碰撞协助高效转录终止。

**真核体外重组系统的单分子研究**
对于RNA聚合酶II（RNA polymerase II, Pol II），RIFT实验显示内在无序区（intrinsically disordered domains, IDRs）对Pol II激活至关重要，但与凝聚体共定位的转录本在激活动力学上无差异；完全重组的系统结合光学镊子可解析特定延伸因子对Pol II延伸动力学的即时效应；DNA序列不但为Rat1依赖性终止做准备，还能引导Pol II自发解离。真核翻译方面，多色单分子FRET研究解析了eIF4F识别mRNA帽、起始位点选择准确性、核糖体扫描、m⁶A修饰对翻译起始的影响、人源mRNA解码动力学以及eRF1/eRF3协同翻译终止；人线粒体中无前导mRNA的翻译可被预组装55S颗粒起始。RNA结合蛋白Sxl通过促进扩散和多价结合靶向msl-2 mRNA 3′UTR，并与Unr、Hrp48动态协作以实现翻译抑制。

**从体外走向活细胞单分子追踪**
体外重组不能完全模拟细胞复杂度，有些复合物如剪接体无法重组。细胞提取物可补充相关因子但可能屏蔽弱相互作用。凝聚体条件可在体外保留类似细胞的分子拥挤性质，如NDF-FACT凝聚体增强Pol II通过核小体转录。在活细胞方面，细菌中DNA修复蛋白的扩散、RNAP空间重排、IF2α与NusA意外互作、NusG少数自由扩散而大部分与rRNA转录工厂或30S结合等发现揭示了转录-翻译偶联的新机制；真核中，活细胞成像跟踪了三种RNA聚合酶和近60个因子的停留时间，多数延伸因子短暂结合便于快速适应调控；定量活细胞成像将凝聚体动力学与转录爆发相关联，接近基因座的凝聚体增加爆发大小和频率。Tanenbaum实验室利用无终止密码子开放阅读框环状RNA（stopless-ORF circular RNAs, socRNAs）编码多个SunTag形成无限翻译环，发现单个核糖体的翻译会导致多聚体中频繁的瞬时碰撞，这些碰撞不被监测机制回收，反而拯救停滞核糖体，称为核糖体协同性；随后用于蛋白酶体降解研究，显示N端降解比内部起始降解更具持续性。稀疏标记TRiC（3%）和前折叠蛋白（9%）显示两种分子伴侣与核糖体动态共定位。

**讨论与结论**
未来发展方向方面，研究人员指出，活细胞内单分子成像受光漂白和自发荧光限制，真正的多色单分子成像仍有限；稀疏标记可观察直接互作但碰撞概率低。将体外重组优势与活细胞成像结合，如纳米孔电穿孔，可实现活细胞三色单分子追踪。此外，单分子荧光与下一代测序联用可将动力学与序列读出直接关联；与冷冻电子断层成像关联可提供反应最终状态的结构快照。该综述总结认为，观察单个生物分子在工作状态中的动态是直观揭示复杂大分子过程机制的最直接途径，近期进展预示着该领域令人振奋的发展前景。