基于人源脂肪间充质干细胞的高通量脂肪生成体外监测方法的开发

《Current Research in Biotechnology》：Development of a high-throughput assay for monitoring adipogenesis in vitro

　　

摘要专业翻译 开发了一个基于人源脂肪间充质干细胞（ASC）的平台，用于实现抗脂肪生成化合物的高通量筛选。研究人员在6孔至96孔板中采用不同的终点检测方法，成功评估了脂肪生成过程。流式细胞术（flow cytometry）能够可靠地定量分化为脂肪细胞的细胞比例。48孔板结合分光光度法（spectrophotometry）在成本与通量之间达到了合理平衡。

论文解读

一、研究背景与意义

全球肥胖流行率持续攀升，世界卫生组织（WHO）已将肥胖列为全球性大流行病，2025年全球超过25亿成年人超重，其中逾8.9亿人达到肥胖标准。现有减肥药物如奥利司他（orlistat）、纳曲酮-安非他酮复方制剂、司美格鲁肽（semaglutide）、利拉鲁肽（liraglutide）等虽有一定疗效，但存在肝损伤、腹泻、失眠、心率加快、血压升高及长期疗效不足等不良反应，因此亟需开发新型、更有效的抗肥胖药物。

目前研究脂肪生成（adipogenesis）最常用的模型是小鼠3T3-L1前脂肪细胞系，但人源间充质干细胞（MSCs）因其可靠性、生理相容性及与人类疾病的相关性而受到更多关注。脂肪组织来源的间充质干细胞（ASCs）具有多向分化潜能，其向脂肪细胞分化的能力使其成为研究人源脂肪生成的优良体外模型。然而，大规模筛选潜在抗肥胖药物库的成本高昂，亟需建立基于人源细胞模型的高通量筛选平台，以实现对大量候选化合物的快速、经济有效的评估。

本研究旨在开发可用于高通量筛选脂肪生成的检测方法，将ASCs向脂肪细胞的分化从常规的6孔板成功升级至96孔板，建立高通量检测平台，为识别新型脂肪生成调控因子、对抗肥胖及其相关合并症提供筛选工具。

二、主要技术方法

研究人员从接受吸脂手术的供体获得脂肪组织（经南非比勒陀利亚大学健康科学学院研究伦理委员会批准，伦理编号237/2019），采用实验室优化的标准化方案分离ASCs并冻存。研究使用第2代ASCs，在含10%胎牛血清（FBS）和2%青霉素-链霉素的完全生长培养基（CGM）中扩增培养。研究人员在6、12、24、48和96孔板中按不同密度接种细胞，以含IBMX、胰岛素、吲哚美辛和地塞米松的脂肪生成诱导培养基诱导分化21天，分别在第0、14和21天通过荧光显微镜、流式细胞术、RT-qPCR和分光光度法评估细胞内脂质积累。采用Bland-Altman统计模型评估不同孔板规格和不同检测方法间的一致性，并进行成本效益分析。

三、研究结果

3.1 细胞内脂滴积累

通过尼罗红（Nile Red）和DAPI双染色的荧光显微镜观察，非诱导对照组细胞在第14和21天均未见细胞内脂滴积累，低水平绿色荧光可能源于内源性荧光物质的自发荧光。诱导组细胞在各孔板规格中均观察到含多个细胞内脂滴的脂肪细胞，表明ASCs成功完成脂肪生成分化。部分细胞可见较大脂滴，提示脂滴融合现象。

3.2 流式细胞术检测尼罗红阳性细胞

流式细胞术定量分析显示，6孔板中ASCs脂肪生成分化比例最高，第14和21天分别为41.85%±6.08%和38.38%±7.87%；12孔板分别为32.96%±5.61%和29.76%±8.26%；24孔板分别为24.63%±3.95%和30.51%±7.56%；48孔板分别为20.92%±6.26%和25.07%±3.64%；96孔板第14和21天分别为31.02%±7.74%和30.02%±7.52%。非诱导组各孔板阳性比例均保持低水平。第14天时，6孔板与24孔板（p=0.0386）及48孔板（p=0.0071）之间存在显著差异，该差异可能源于不同供体的生物学变异及实验技术变异。

3.3 油红O分光光度法定量

油红O（Oil Red O）提取后的光密度（OD）值经平均细胞数归一化后显示，6孔板诱导组第14天OD值最高（23.20±6.85），第21天为10.47±2.77。第14天各孔板诱导组OD值分别为：12孔板22.16±6.31、24孔板11.29±1.48、48孔板16.87±1.97、96孔板22.07±4.94，各孔板间无统计学差异。诱导组OD值总体高于非诱导组，但差异未达统计学显著水平。研究人员注意到未结合油红O易吸附于塑料表面，导致小孔板非诱导组OD读数偏高。

3.4 RT-qPCR定量脂肪生成相关基因表达

第14天，PPARG、CEBPA、CD36和FABP4的相对表达量在各孔板间无显著差异。第21天，CEBPA表达在6孔板与24孔板、12孔板与24孔板以及24孔板与48、96孔板之间存在差异，但由于成功重复数不足，这些观察仅为描述性结果。96孔板因RNA产量过低，仅获得一份培养的CD36结果（第21天）。总体而言，6、12和24孔板能稳定获得足够的mRNA浓度，而48和96孔板在某些孔中RNA产量不足，成为小孔板用于RT-qPCR分析的主要限制。

3.5 统计建模

Bland-Altman分析显示，流式细胞术在24孔板中变异度最低（第14和21天），96孔板变异度最高。分光光度法在第14天以48孔板变异最低，第21天以12孔板变异最低。以流式细胞术为参考方法比较各检测方法时，分光光度法在所有孔板规格中均表现出最低变异度。RT-qPCR的PPARG和FABP4基因表达分析均显示24孔板变异度最低。总体而言，24孔板产生的结果变异度最小，96孔板变异度最高。所有孔板规格的数据均具有可比性，最终检测方法的选择取决于结果可靠性和成本效益等因素。

3.6 成本分析

以筛选100种化合物（三次重复）为假设场景，分光光度法（48孔板）成本最低（R30 998；$1658.53），其次为流式细胞术（48孔板）（R39 234.88；$2099.24），RT-qPCR（12孔板）成本最高（R97 612.73；$5222.72）。流式细胞术和分光光度法可相对可靠地升级至48孔板，12孔板是能稳定获得足量mRNA的最小孔板规格。

四、讨论与结论

本研究表明，ASCs的脂肪生成分化可在6至96孔板所有规格中成功实现。流式细胞术和分光光度法可可靠升级至48孔板，而96孔板变异度较高。分光光度法是成本效益最高的方法，可作为筛选具有抗脂肪生成活性药物的初始筛选工具。各检测方法各有优劣，适用于筛选流程的不同阶段：流式细胞术具有高定量性，可在单细胞水平提供药物影响的详细信息；RT-qPCR在评估候选药物对基因表达的影响方面发挥重要作用。本研究首次比较了不同孔板规格及不同检测平台（RT-qPCR、分光光度法、流式细胞术和显微镜）的数据可比性。研究证实流式细胞术、分光光度法和RT-qPCR均可成功用于小孔板规格的脂肪生成评估，实现高通量筛选。使用小孔板更省时且更具成本效益。下一步重要工作是采用已确立的抗脂肪生成化合物（如PPARγ拮抗剂和其他脂肪生成抑制剂）验证该高通量平台的药理学筛选适用性，进一步证明优化后的检测平台在识别和表征潜在抗肥胖药物方面的实用价值。